大肠杆菌高效表达的HCVE2蛋白在丙型肝炎检测中应用

为探讨大肠杆菌高效表达的HCV E2蛋白在丙型肝炎诊断中应用价值,采用了238份HCVRNA阳性血清标本进行了E2抗体和抗HCV测定,方法采用ELA,和PCR法.结果有164份E2抗体阳性,占68.9%,卡方检验P＞0.05;用抗HCV检测与E2抗体测定方法比较,两种方法无显著性区别（P＞0.05）;在HCV RNA阳性,抗HCV阴性的血清中,有半数可测出E2抗体的阳性.提示在大肠杆菌中高效表达了可溶性的HCV E2蛋白,纯化后可进行E2抗体测定,且E2抗体阳性数与HCVRNA,抗HCV阳性数无显著性差别,E2抗体可以检出一部分抗HCV检测不能检出的HCV感染者.     

丙型肝炎病毒E1、E2 蛋白的表达及初步用于丙型肝炎患儿血清学诊断的临床研究

在昆虫细胞中表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E1和E2,将该蛋白应用于丙型肝炎患儿血清抗体的检测。用PCR方法自HCV H株扩增出包膜蛋白E基因,构建重组杆状病毒,在昆虫细胞中稳定表达包膜糖蛋白E1和E2,并用此蛋白与56例丙型肝炎患儿血清反应。在56份HCV感染者血清中,有7例E1抗体阳性,其中2例检出E2抗体。在16例PCR检测HCV RNA阳性而抗HCV阴性的血清中,有5例与表达的E1蛋白反应。HCV E蛋白基因表达的E1蛋白可用于HCV患儿的血清学诊断。     

采用重组侧链二氧酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体及其临床意义

目的 探讨用重组表达的侧链二氧酸脱氢酶复合物E2亚单位（BCOADC—E2）检测M2抗体，以早期诊断原发性胆汁性肝硬化（PBC）。方法 重组表达BCOADC—E2，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹法（IBT）来检测PBC患者的M2抗体，并以健康体检者、自身免疫病患者、其他非胆汁性肝硬化患者为对照组。结果 60例肝病患者血清中检测出抗BCOADC—E2抗体阳性33例，阴性者为27例，阳性率为55％，而健康体检者和疾病对照组血清中M2抗体检测均为阴性。结论 采用重组表达的人侧链二氧酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体，有一定的特异性，对于早期诊断PBC有一定的辅助参考作用。     

改进检测高危人群HCV抗体的方法

用ELISA法检测非甲非乙型肝炎病人血清抗c100-3的阳性率为60～80%,仍有20～30%为阴性。在抗c100—3阴性的患者似乎有抗HCV的其他结构和非结构蛋白的抗体。为此,作者改用第二代ELISA方法和重组免疫印迹试验(RIBA)来检测血清中HCV基因的核壳体区(c22—3)和NS_3/NS_4(c33 c,c200)表达产物的抗体。作者用三种方法检测313例HCV感染高危人群370份血清标本和170例低危人群的184份血清标本。高危人群指急慢性HCV感染。原发性肝癌、静脉药瘾者和血液透析病人;低危人群指甲型或乙型肝炎患者、原发性胆汁性肝硬化、酒     

抗戊型肝炎病毒E2 IgM诊断急性戊型肝炎的敏感性和特异性

目的评价抗戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白重组抗原E2 IgM（抗-E2 IgM）诊断急性散发性戊型肝炎的敏感性和特异性。方法用酶联免疫吸附法检测176份急性散发性戊型肝炎和191份急性散发性非甲～非戊型肝炎患者血清中抗-E2 IgM，与国产传统试剂和新加坡Genelabs试剂检测的IgM（GL—IgM）作比较；对抗-E2 IgM阳性血清检测血清中HEV RNA，采用logistic回归分析检测抗-E2 IgM和HEV RNA的相关因素。结果在176份急性戊型肝炎患者血清中，抗-E2 IgM的检出率为68．75％，国产传统试剂抗-HEV IgM检出率为56．25％，x^2IgM=6．49，P〈0．05。在191份急性非甲～非戊型肝炎血清中有37例（19．37％）抗-E2 IgM阳性，其中11例GL—IgM同时阳性；在158份抗-E2 IgM阳性血清中，有81例HEV RNA阳性（51．27％），其中急性戊型肝炎的阳性率为57．02％，急性非甲～非戊型肝炎的阳性率为32．43％，23例抗-E2 IgM阴性的急性戊型肝炎患者的血清，无一例检测到HEV RNA。Logistic多因素回归分析发现，抗-E2 IgM的检出率与发病至人院时间、年龄、血清胆红素、血清氨基转移酶水平无关，血清丙氨酸氨基转移酶水平与HEV RNA水平呈正相关（P=0．024）。结论抗-E2 IgM是HEV急性期感染敏感性和特异性强的血清学指标；HEV感染仍是部分临床诊断为急性非甲～非戊型肝炎的病因；持续HEV病毒血症可能是影响急性戊型肝炎病情的重要因素。     

HCV血清分型方法的建立及其评价

目的建立HCV血清分型方法,评价其在慢性丙型肝炎(丙肝)抗体阳性标本中的分型率及血清型与基因型的相关性。方法克隆表达HCVCore、非结构蛋白(non-structural protein,NS)4两个区段的型别特异性表位嵌合抗原,并应用酶联免疫竞争抑制法建立血清分型方法。分别应用酶联免疫吸附试验和聚合酶链反应法检测200例慢性丙肝患者的血清抗体和HCVRNA,并用建立的方法进行血清分型。同时采用该方法检测90例乙型肝炎患者、11例戊型肝炎患者和16例其他肝病患者的血清,评价其特异性。结果在200例慢性丙肝患者的血清标本中,基因1b型128例,2a型72例,型别特异性抗体阳性157例,分型率为78.50%,与基因型一致率为98.09%。而在另外117例乙型肝炎、戊型肝炎和其他肝病患者的血清中,均未检测出HCV型别特异性抗体。结论建立的HCV血清分型方法具有较高的分型率和特异性,可用于HCV抗体的血清学分型和预测干扰素疗效。     

丙型肝炎病毒F蛋白抗原性及患者血清F抗体流行率的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白的抗原性及患者血清F抗体的流行率。方法利用11条引物延伸获处HCV f基因,以此为模板经聚合酶链反应扩增得到截短型f65基因片段,定向克隆至pET32a(+),重组子转化大肠杆菌Plyss菌株,异丙基β半乳糖苷诱导后用镍离子树脂纯化HCV F65蛋白。以F65蛋白为抗原,酶联免疫吸附法检测HCV感染者血清中F抗体。应用F65蛋白免疫新西兰大白兔制备多克降F抗体,再用葡萄球菌A蛋白树脂纯化兔血清中F抗体。结果成功构建了pET32a(+)f65重组子,表达并纯化了分子量为3．2×10~4的HCV F65蛋白。30份HCV患者血清F抗体的A_(450)为0．125+0．061．F抗体阳性率为63．3%。获得了兔源性F抗体,该抗体与HCV F65蛋白发生特异性结合反应,滴度为1：30000。结论HCV F65蛋白具有抗原性,可用来检测血清中F抗体。HCV患者血清中存在F抗体。兔源性F抗体可用来检测HCV F蛋白。     

丙型肝炎病毒E1、E2蛋白表达及诊断丙型肝炎的临床研究

丙型肝炎病毒（ECV）基因编码的E1和E2是病毒体包膜糖蛋白,该蛋白在昆虫细胞中已成功进行表达.本研究应用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达HCV包膜糖蛋白E1和E2,并用于丙型肝炎患儿血清抗体检测.     

3-磷酸甘油酸脱氢酶及其抗体对自身免疫性肝炎的诊断意义

目的 克隆D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(Phgdh)的cDNA,构建重组表达质粒,纯化重组蛋白,初步探讨Phgdh抗体在自身免疫性肝炎诊断中的意义. 方法血清蛋白质组学方法鉴定差异蛋白,构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达,融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot法进行免疫鉴定;应用表达蛋白建立间接酶联免疫吸附法,检测60名健康体检者、65例自身免疫性肝炎(AIH)、122例原发性胆汁性肝硬化、56例慢性乙型肝炎,117例慢性丙型肝炎患者血清中抗Phgdh抗体.组间率的比较用χ2检验.结果 经重组质粒测序和酶切鉴定结果证实,Phgdh目的 基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物在相对分子质量约6.0×104附近有一明显的蛋白表达带,Western blot分析结果显示重组蛋白具有Phgdh抗原反应性.酶联免疫吸附法检测血清标本结果显示,AIH、原发性胆汁性肝硬化、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及正常人抗Phgdh抗体阳性检出率分别为66.15%、21.42%、12.50%、6.83%和3.30%.AIH组Phgdh自身抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01).结论 本研究成功克隆了Phgdh的cDNA,并将其在大肠杆菌中成功表达.该抗体主要在AIH患者中检出,此抗体的检测有助于提高AIH的临床诊断水平.     

组织蛋白酶B酶联免疫吸附测定方法的建立

组织蛋白酶B（CB）与恶性肿瘤的分期、转移和预后关系密切。目的：建立CB酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，以便评价肿瘤患者血清CB含量与预后的关系。方法：将含有CB cDNA的重组痘苗病毒转染Hela细胞，表达目的蛋白重组CB；经Western blot分析和制备型电泳纯化后，免疫新西兰大白兔，获得CB多克隆抗。纯体后的抗体一部分作为固化抗体，另一部分用辣根过氧化物酶标记；棋盘滴定法确定工作浓度。结果：痘苗病毒真核表达系统可以高效表达目的蛋白。制备型电泳能简单、有效地纯化蛋白。重组CB免疫动物后，可获得高效价的CB多克隆抗体，用以制备相应的固化抗体和酶标抗体检测CB。结论：用重组CB免疫动物后可获得相应抗体，以建立CB检测的ELISA方法。