大肠杆菌表达的乙型肝炎表面抗原124aa分子的纯化和免疫学鉴定

目的探索大肠杆菌表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)124aa分子作为疫苗成分应用的可能性. 方法以超声破碎法获取包涵体,用HisTrapTM试剂盒亲和层析纯化目的蛋白,加入聚乙二醇(PEG4000)以提高变性蛋白的复性效率;以抗HBsAg a抗原决定簇单克隆抗体(McAb)和抗HBsAg多克隆抗体(PcAb)作为包被抗体,采用夹心 ELI SA法分析其抗原性;以纯化产物免疫BALB/c小鼠,RIA法测定小鼠血清中抗HB s抗体.结果通过HisTrapTM试剂盒亲和层析纯化的HBsAg124aa分子经反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析,纯度达95 %以上 ;经复性后的蛋白具有抗原性和免疫原性.结论 HBsAg124aa 分子在大肠杆菌中的成功表达,为探索新的乙型肝炎疫苗成分提供了重要线索.     

乙型肝炎免疫学模式的构成比分析

目的了解乙型肝炎在本地区的流行及感染特征。方法对2012年一年间来我院就诊及体检者的3051例血清样本进行乙型肝炎免疫学标志物检测并将其免疫学模式进行构成比分析。结果 3051例血清标本中,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性病例1846例,占总例数的60.5%,其中抗-HBc-IgM阳性者152例,占阳性病例的8.23%;HBsAg阴性病例1205例,占总检测人数的39.5%。结论肝病医院是乙型肝炎患者及高危人群相对集中的场所,乙型肝炎感染形势、流行监控和卫生宣教工作仍然不容乐观,应引起传染病研究者、医务工作者、卫生防疫及保健工作者的高度重视。     

乙型肝炎病毒核心抗原蛋白表达纯化及免疫学分析

研究重组乙型肝炎病毒HBcAg蛋白表达条件和纯化方法，并对使用该方法纯化的抗原的理化性质和免疫原性进行分析。改变表达产物的培养和诱导表达条件，使用离子交换和分子筛进行层析纯化，用BALB／C小鼠进行动物效力试验。结果使蛋白以可溶形式表达，得到了纯度较高、抗原性较好、产生抗体滴度高的抗原蛋白。本试验介绍的HBcAg纯化方法较易扩大，可重复性好，为大量制备HBcAg蛋白提供了简洁高效的方法；并为以后进一步试验与其他抗原联合免疫制备有效的治疗性疫苗打下了良好的基础。     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

粒／巨噬细胞集落刺激生长因子在大肠杆菌内的表达及纯化

位／巨噬细胞集落刺激生长因子（GM－CSF）是最早发现的造血生长因子之一。美国FDA已批准重组人GM－CSF进入临床及市场，用于治疗艾滋病、肿瘤及白细胞减少等疾病。要获得大量均一的天然GM－CSF比较困难。1985年Wong及Lee分别克隆了人GM－CSF的CDNA，并在COS细胞内表达成功。19     

大肠杆菌异源蛋白的表达与纯化研究近况

真核生物蛋白、多肽等活性物质由于自然状态下产量低,限制了利用与进一步的研究。通过基因工程手段,可以利用微生物合成丰富的该类蛋白。综述了利用分子伴侣、折叠酶等手段增加大肠杆菌表达异源蛋白溶解性的研究及包含体处理的新进展。     

龙葵多糖的分离,纯化和鉴定

从中草药龙葵的水提取液中分离得到两种多糖ＳＮＬ－１，ＳＮＬ－２。分别经比旋光度法，凝胶柱层析法分析，证实均为单一组分。ＳＮＬ－１，ＳＮＬ－２经酸水解，Ｓｍｉｔｈ法降解，红外光谱分析等确知，ＳＮＬ－１由Ｌ－鼠李糖、Ｄ－木糖，Ｌ－阿拉伯糖和Ｄ－葡萄糖组成，摩尔庇为４．９：１：２．４：１３，Ｍｒ为５３０６；ＳＮＬ－２由Ｄ－葡萄糖、Ｌ－阿拉伯糖组成，摩尔比为１３．３：１，Ｍｒ为１１２０。ＳＮＬ－１以１，４     

大肠杆菌L—天门冬酰胺酶的提取和纯化

用蔗糖溶液提取菌体细胞周质中的天门冬酰胺酶，所获得的粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维柱层析和羟甲基纤维素柱层析纯化，获得了比活为220IU/mg，SDS-PAGE显示一条带的L-天门冬酰胺酶。     

表面抗原定量在慢性乙型肝炎抗病毒治疗中的研究现状

慢性乙型肝炎在我国仍是一大疾病,其疾病进展及并发症严重威胁到我国国民健康,随着抗病毒治疗的普及,疾病的进程得到一定的延缓甚至逆转,表面抗原定量在慢性乙型肝炎病人的抗病毒治疗中可起到指导作用,该研究就目前表面抗原定量在慢性乙型肝炎治疗中的研究进展进行简单分析。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。     

rhIL-6大肠杆菌高效表达的影响因素及其产品中试的研究

研究自构建的重组人白细胞介素－ ６（ｒｈＩＬ－６）基因工程菌株高效表达的影响因素及其ｒｈＩＬ－６产品中试工艺。方法：①将ｒｈＬ－６－ＰＢＶ重组质粒转化至ＲＲＩ、ＪＭ１０３和 ＤＨ５ ａ不同宿主菌中,在Ｍ９ＣＡ和 ＬＢ培养基中,４２℃诱导培养不同时间（３～６ ｈ）,观测 ｒｈＩＬ－６不同表达效率。②采用 １０ Ｌ发酵罐诱导培养,经破菌－洗包－溶包初步纯化后,再经三步柱层析纯化,提取ｒｈＩＬ－６。结果：①ｒｈＩＬ－６在ＤＨ５ ａ大肠杆菌中（ＳＤＨ－９４５株）表达效率高;可达 ３９％,用 Ｍ９ＣＡ培基,４２℃诱导培养 ５ｈ可使表达效率提高到４１％,②ＳＤＨ－９４５菌株在５批 １０Ｌ Ｍ９ＣＡ发酵诱导培养 ５ ｈ,ｒｈＩＬ－６表达效率可达 ３５． ８７±２． ６５％。经初步纯化后,ｒｈＩＬ－６的纯度达 ７４． ８７±３． ６８％,再经三步柱层析后,纯度可达 ９５％以上,比活性达 ４ × １０８ Ｕ／ｍｇ,总得率稍低可达 ２３．１％．结论：①ＳＤＨ－９４５工程菌株在 Ｍ９ＣＡ培养基巾,４２℃诱导培养 ５ ｈ,ｒｈＩＬ－６表达效率最佳。②１０ Ｌ发酵和纯化工艺可获高效价、高比活性、高纯度的ｒｈＩＬ－６合格生物制品。     

乙型肝炎病毒感染者血清前S1抗原检测的临床意义

目的：分析乙型肝炎病毒（HBV）前S1抗原与其他HBV标志物的关系，并探讨其相应的临床意义。方法：用酶联免疫吸附试验方法（EHSA）检测95例HBV病毒感染者血清标志物和前S1抗原，并对结果进行分析。结果：前S1抗原在HBeAg阳性组合中的检出率明显高于HBeAg阴性组合者（P〈0．05）；HBV感染者抗HBc-IgM与前S1抗原检出率差异有显著性（P〈0．05），HbcAb-IgM与前S1抗原的关系不密切（r=-0．1045）。结论：前S1抗原是反映HBV感染、复制的指标，与HBV标志物联合检测可为乙型肝炎的诊断、治疗提供更可靠的依据。     

头孢曲松钠治疗大肠杆菌所致疾病机制的研究

目的探讨头孢曲松钠对大肠杆菌(E.coliK1)的作用机制。方法采用对照实验,培养E.coliK1至最佳状态,实验组细菌加入头孢曲松钠100μg,对照组加入生理盐水,孵育1h。通过western-blot方法检测E.coliK1外膜蛋白A的表达变化,软件分析蛋白表达灰度值。结果实验组OmpA与对照组比较,表达量明显下降。结论头孢曲松钠可以诱导E.coliK1的外膜蛋白A表达下降,从而影响E.coliK1外膜的完整性。     

重组E.coli L-天冬酰胺酶在大鼠中的药物代谢动力学

应用放射性核素示踪技术研究^125I重组E.coliL－天冬酰胺酶在大鼠体内的药物代谢动力学。^125I重组L－天冬氨酶静脉注射后24h内，在尿、粪、胆汁中的排泄量分别占注射剂量的68．95％，4．44％和5．36％。测定血浆中^125I重组E.coliL－天冬酰胺酶浓度，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物成像分析系统结合方法评价原药水平，由房室模型评价药物动力学参数，静注后，浓度时间曲线符合二房室模型，初期和末端的t1/2分别为0．52－0．63h和2．39－2．76h，AUFC与剂量成正比。重组E.coliL－天冬酰胺酶的分解代谢产物主要随尿液排泄，重组E.coliL－天冬酰胺酶在大鼠中的药物热力学参数为临床试验提供了有用依据。     

慢性乙型肝炎患者肝组织内HBcAg表达的临床研究

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者肝组织内HBcAg的表达与肝组织的炎症、纤维化程度、血清中的HBV DNA、HBsAg以及HBeAg定量之间的关系。方法 选择安徽医科大学第一附属医院2013年3月至2014年3月收治的103例CHB患者,按病理学结果分为S1组（36例）和S2~3组（67例）。利用免疫组化技术检测肝细胞内HBcAg的表达,同时利用FirbScan仪器测定患者的肝纤维化程度。结果 在S2~3组中,肝组织HBcAg的表达与血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平及肝纤维化指标均呈现显著的相关性（P<0.05）,在S1组中均无显著相关（P>0.05）。结论 HBcAg在肝细胞中的表达与机体血清中DNA、HBsAg、HBeAg水平及无创肝纤维化程度存在一定的相关性。     

前S1抗原检测在乙型肝炎诊断中的应用

目的 通过对乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原与HBV血清标志物检测的对比分析,对HBV前S1抗原的临床意义进行探讨.方法 用酶联免疫吸附实验(ELISA)对HBV血清标志物和HBV前S1抗原进行检测.结果 对HBV血清标志物不同组合模式进行分析发现:HBV血清标志物传染性强(HBeAg阳性)的模式中,HBV前S1抗原的检出率为94.0%;HBV血清标志物传染性弱(HBeAg阴性)的模式中,HBV前S1抗原的检出率为15.6%;乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)均为阴性的模式中,HBV前S1抗原均是阴性.结论 HBV前S1抗原与HBeAg在很大程度上具有一致性,其阳性可作为HBV复制的重要依据和HBV存在的指标.     

重组羧肽酶原B在大肠杆菌中的可溶性表达及活性羧肽酶B的纯化

实现羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中的可溶性表达,并对表达产物进行激活和纯化,得到活性CPB.采用摇瓶发酵,对诱导温度,诱导时间,诱导剂IPTG的浓度进行优化,促成其可溶性表达;优化酶解激活条件,提高粗酶液比活.粗酶液用DEAE-FF离子交换柱和Octyl-FF疏水柱两步纯化.结果：实现可溶性表达的最佳条件为15℃下,0.1 mmol/LIPTG诱导20 h.此条件下得到的粗酶液经激活后两步纯化,得到比活为128.2 u/mg protein的较纯的活性CPB,活性回收率达39%.