大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法的改进☆

背景：间充质干细胞在骨髓中的含量很低,需进行体外分离纯化和大量增殖。 目的：优化骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增的方法,拟提高骨髓间充质干细胞的获得率和扩增率。 设计、实施及地点：以细胞为对象的观察实验,于2007-03/2008-02在南方医科大学珠江医院血液科实验室进行。 材料：实验动物为6~8周龄清洁级雄性大鼠,体质量130~150 g。 方法：采用改进的贴壁法培养骨髓间充质干细胞：保留大鼠肱骨、股骨和胫骨,尽量将骨周边组织剔除干净,从而减少混杂的细胞;冲洗骨髓腔时,选用2.5 mL的注射器,可以将紧贴骨髓腔壁的骨髓间充质干细胞吹洗下来,从而提升获得率;细胞换液时未全部倾去旧培养液,保留了1/4~1/5的旧培养液;采用“二传一” 的方法将两瓶原代细胞分别消化后合为一瓶,保证传代时对细胞数目的要求,能避免细胞过度老化。 主要观察指标：倒置光显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察, 流式细胞术进行细胞周期分析,MTT法和克隆形成实验测定细胞P1和P5生长曲线和克隆形成能力,用流式细胞仪和碱性磷酸酶对培养进行细胞鉴定。 结果:分离的骨髓间充质干细胞大小较为均匀, 基本上呈梭形或星形。原代培养细胞传代后,细胞增殖速度较快,基本上三四天传代1次,随传代次数的增加细胞形态趋于一致细胞基本为成纤维细胞型。流式细胞术证明G0G1期的细胞约占80%以上。细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期, 至第五天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢、克隆能力降低。经流式细胞仪检测显示CD44、CD99阳性,CD45阴性,碱性磷酸酶试验为阳性。 结论：采用改良的的方法获得了大量遗传性质均一、功能状态良好的骨髓间充质干细胞,并有效地提高了细胞的获得率和扩增率。     

大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件

背景：间充质干细胞适合生长、培养的条件尚不十分明确,目前对于间充质干细胞的分离纯化以及体外培养亦没有统一的方法,而培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是进行以上实验的重要前提。 目的：寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 设计、时间及地点：分组对比观察,实验于2007-04/09在重庆医科大学附属第一医院实验中心完成。 材料：6~8周龄雄性Wistar大鼠1只,体质量120 g,用于间充质干细胞的分离及培养。 方法：采用全骨髓培养法获取间充质干细胞,按不同接种密度(1×106,5×105,1×105,5×104,1×104 cm-2)、血清体积分数(体积分数5%,10%,15%的胎牛血清)、首次换液时间(接种后6,12,24,48,72 h)及pH值(分别为7.0~7.1,7.1~7.2,7.2~7.3,7.3~7.4,7.4~7.5)分组接种,10 d后进行活细胞计数。 主要观察指标：不同培养条件对间充质干细胞生长的影响;倒置显微镜下观察原代及传代间充质干细胞的形态变化;采用四甲基偶氮唑盐法绘制细胞的生长曲线,并计算细胞倍增时间;常规SABC免疫组织化学法检测传代间充质干细胞CD44、CD34的表达;流式细胞仪检测传代间充质干细胞生长周期。 结果：①以1×106,5×105 cm-2密度接种的细胞数较多,余3种接种密度获得细胞数明显低于上述2种密度(P < 0.05)。首次换液时间为48 h获得的细胞数量最多,各组间相比,差异有显著性意义(P < 0.05)。体积分数5%血清组较体积分数10%、15%血清组细胞数量少(P < 0.05)。pH值为7.1~7.2,7.2~7.3的培养液细胞生长活跃,细胞数量多,以pH值为7.0~7.1和pH 7.4~7.5培养的细胞生长缓慢,数量较少。②刚接种的间充质干细胞呈圆形,培养6~8 h后开始贴壁,呈纺锤状或类圆形;约10 d左右细胞基本汇合长满瓶底;传代后,细胞形态以梭形为主;经过一二次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致。③传代一二天细胞生长缓慢,生长停滞期;自3 d起,细胞生长进入对数生长期,四五天达到高峰;之后进入平台期,细胞倍增时间约为39.5 h。④传代间充质干细胞存在CD44抗原表达,而CD34呈阴性表达。⑤传代后82.93%的间充质干细胞处于G0/G1期,G2+M+S期细胞占17.07%。 结论：细胞较佳接种密度为5×105 cm-2,合适血清体积分数为10%,首次换液时间为48 h,pH值为7.2左右;在适宜的培养条件下,间充质干细胞在体外生长状态良好,增殖速度快。     

人骨髓间充质干细胞体外培养特性的初步观察

目的　观察人骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)在体外培养时的生物学特性。方法　应用密度梯度离心法将MSCs自骨髓中分离出来 ,利用其贴壁生长的特性加以纯化 ,在常规培养条件下观察其形态学及生长增殖特性。结果　从人骨髓中可分离得到间充质干细胞 ,流式细胞仪检测纯度较高。培养的MSCs呈成纤维细胞样 ,以克隆形式增殖 ,生长曲线示在对数生长期细胞群体倍增时间为 3 3h。结论　骨髓间充质干细胞可有效分离 ,体外培养表现出旺盛的增殖能力。     

不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨分化

背景：目前成人骨髓间充质干细胞体外培养成骨定向分化的研究较多,甚少见有不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨定向分化生物学特性差异的报道。 目的：研究不同年龄儿童骨髓间充质干细胞的自体血清体外培养条件与方法,并探讨其成骨诱导分化后的基本生物学特性。 方法：无菌条件下收集3个不同年龄组儿童骨髓悬液,分离人骨髓间充质干细胞,采用含自体血清的培养基培养;测定细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原;取传代培养细胞,经β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松进行成骨诱导分化后,采用免疫组织化学法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原以及钙结节形成,以评价其分化效率;倒置相差显微镜逐日观察原代、传代及诱导分化细胞的生长情况及形态学改变。 结果与结论：3组儿童培养的人骨髓间充质干细胞,经刺激培养后细胞表面抗原CD29、CD44为阳性,CD34、CD45、CD105、CD106及HLA-DR均为阴性,各组表达强度差异无显著性意义。不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长速度以及分化效率随年龄增大而减小。结果提示通过对不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,自体血清可作为安全有效的培养方法,且年龄越小,分化效率相对越高。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和定向神经分化

目的 探讨成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和定向神经诱导分化的条件.方法 从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有脑源性生长因子(BDNF)联合维A酸(RA)的培养液对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定.结果 诱导1h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,6h后大部分细胞具有典型神经元形态.表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞占细胞总数的(46.45±2.54)%.结论 MSCs可通过体外培养并纯化,应用BDNF联合RA可以在体外诱导MSCs成为神经元样细胞.     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化*

背景：间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景。但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一。 目的：建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力。 方法：采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定。 结果与结论：通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形。经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景：为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的：比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料：16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法：采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标：①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果：①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P < 0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P < 0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P < 0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P < 0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P < 0.05)。 结论：脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导**☆

背景：研究表明骨质疏松症可能是间充质干细胞分化失衡后过多地向脂肪细胞分化所致。因此,探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义。 目的:分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件。 设计、时间及地点：以细胞为对象,重复观察测量实验,于2007-10/2008-07在广东医学院药理教研室完成。 材料：1月龄SD雄性大鼠由广东医学院实验动物中心提供。 方法:无菌条件下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴壁培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养。第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用内含0.1 mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1 μmoL/L地塞米松、不同浓度胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。 主要观察指标：①倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征。②油红O染色检测骨髓间充质干细胞成脂肪分化情况。 结果: ①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞。②体积分数为0.05和0.1胎牛血清均能获得较好的成脂分化效果,胎牛血清体积分数增至0.2反而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化（P < 0.01）。③10 mg/L胰岛素可获得较好的成脂分化效果,胰岛素质量浓度提高到20,40 mg/L并不能增加骨髓间充质干细胞的成脂分化效果（P > 0.05）。④低糖（含葡萄糖1 g/L）和高糖（含葡萄糖4.5 g/L）DMEM对骨髓间充质干细胞的成脂分化无影响（P > 0.05）。 结论：骨髓间充质干细胞经内含0.1 mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 mg/L胰岛素、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1 μmoL/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景：目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/小牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少。 目的：观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定。 结果与结论：脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖。流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变。     

骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞转化：不同时期心肌梗死区域的最佳微环境**☆

背景：骨髓间充质干细胞移植能够有效改善心肌梗死后的心功能,其作用机制可能与移植部位大量肌纤维母细胞的聚集有关,但至今仍缺少证据来证实聚集的肌纤维母细胞是由骨髓间充质干细胞还是由成纤维细胞转化而来？ 目的：观察不同时期心肌梗死微环境对大鼠骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞转化的影响。 方法：将培养组分为3组：大鼠骨髓间充质干细胞、心脏成纤维细胞单培养组,以及两种细胞共培养组,加入心肌梗死后不同时期心肌匀浆干预7~28 d,并设立不加心肌匀浆的空白对照组,运用免疫细胞化学染色方法,检测不同干预组间平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及成纤维细胞转化为肌纤维母细胞数量间的差异。 结果与结论：加用心肌梗死第14天梗死周边区域心肌匀浆干预的共培养组,检测到心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的阳性率最高。提示心肌梗死后微环境下,骨髓间充质干细胞能诱导诱导心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞,而心肌梗死后14 d的心肌梗死微环境是骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的最佳微环境。     

体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝干细胞分化的特征**★

目的：骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现具有重要的临床应用价值,可用其作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞,以解决供体缺乏，同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多问题。为此，实验模拟肝脏发育的微环境，观察体外诱导分化大鼠骨髓干细胞为肝干细胞的可行性及特征。 方法：实验于2006-10/2007-08在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成。①实验动物: SPF级SD大鼠，2月龄，体质量（200±20） g,雌雄不拘，购于上海斯莱克实验动物公司。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度分离法分离培养大鼠骨髓干细胞，并设诱导组和非诱导组，应用25 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维生长因子-4、10 μg/L干细胞生长因子共同诱导。③实验评估：于诱导第0，7，14，21，28天，观察细胞形态变化，采用放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白浓度，免疫组织化学染色检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的表达，应用流式细胞仪检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19表达阳性细胞比例。 结果：①诱导培养的骨髓干细胞呈卵圆形或圆形的肝干细胞样改变。②放射免疫法检测到诱导组细胞甲胎蛋白浓度逐渐升高，第14天达高峰，随后呈下降趋势，与非诱导组相比，除第0，7天无差异，其余各时间点差异均显著（P < 0.05）。③免疫细胞化学法检测到诱导组细胞特异性表达甲胎蛋白、细胞角蛋白19及白蛋白，非诱导组不表达3种蛋白。④流式细胞分析诱导组甲胎蛋白阳性细胞比例为66.20%、细胞角蛋白19阳性细胞的比例为44.96%。 结论：在实验建立的诱导培养体系中，骨髓干细胞在体外能分化为肝干细胞样细胞，诱导细胞有分泌甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

骨髓间充质干细胞体外培养及其归巢机制

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能的特性,体外可多次传代培养,在特定的情况下,多种因子参与调控其到达损伤的组织器官进行修复重建。目的：综述骨髓间充质干细胞归巢机制及其临床应用前景。方法：应用计算机检索1999-01/2008-12 SCI数据库相关文章,检索词为“bone marrow mesenchymal stem cell,homing,clinical,therapy”,并限定文章语言种类为English。共检索到文献66篇。结果与结论：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下,这类细胞可归巢到特定的组织并分化为相应组织细胞,发挥修复重建作用,此外,它还具有易提取、扩增能力强、不存在伦理问题和排斥反应等优点,由于这些优点,其将成为当今社会医学领域中很多难治之症的希望所在。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞***

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：目前骨髓间充质干细胞已经应用于多种组织血管的修复,但涉及尿道血管组织的报道甚少。 目的：探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在苏州大学附属儿童医院儿科研究所完成。 材料：清洁级4周龄SD大鼠4只,由苏州大学实验动物中心提供。作为诱导剂的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子为Sigma公司产品。 方法：密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞达80%~90%融合时消化传代。传至第3代,细胞按1×109 L-1密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化。 主要观察指标：MTT测定细胞生长曲线,免疫荧光法检测细胞表面CD44与Vimentin的表达,光学倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,电镜观察细胞超微结构。 结果：骨髓间充质干细胞生长曲线呈倒“S”型,第3 代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性率分别为89.3%和85.6%。向血管内皮细胞诱导1~3 d细胞呈梭形或纺锤形,7 d后变成不规则的圆形或椭圆形,胞浆淡染,胞核较大,核染色质粗,且部分细胞死亡,14 d后整瓶细胞呈漩涡状生长,21~25 d后细胞密集处呈内皮细胞特有的铺路石样排列。诱导后第21天,细胞浆内可见微管、微丝及W-P小体。 结论：血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞因子联合诱导条件下,骨髓间充质干细胞在体外可分化为血管内皮细胞。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增。选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%)。细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性。     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白,可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化。LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力。 目的：观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果,及对其分化的影响。方法：大鼠骨髓间充质干细胞分离培养,传代后,检测特异性标记物CD44的表达情况,矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率,RT-PCR及Western blot验证感染效果,观察感染Ad-LMP-1 2,7,14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响。结果与结论：传代细胞形态一致,排列紧密。矿化液诱导后,细胞形态明显改变。茜素红染色结果表明,诱导后出现钙化结节。观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变,14 d出现类钙化结节,但不伴有细胞增殖活力改变。结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化。