不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景：目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/小牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少。 目的：观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定。 结果与结论：脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖。流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景：为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的：比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料：16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法：采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标：①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果：①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P < 0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P < 0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P < 0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P < 0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P < 0.05)。 结论：脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞***

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化

背景：自体干细胞移植治疗可以克服异体干细胞移植治疗的局限性,但目前对于进行性肌营养不良模型mdx鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及肌分化潜能研究未见报道。 目的：拟建立体外分离培养mdx鼠骨髓间充质干细胞的方法,并观察其成肌分化能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-01/07在中山大学附属第一医院神经病学实验室完成。 材料：4~6周龄纯系雄性mdx鼠10只,购自美国Jackson实验室,饲养于中山大学北校区动物实验中心。碱性成纤维细胞生长因子和兔抗鼠MHC抗体为Chemicon公司产品。 方法：全骨髓法体外分离mdx鼠骨髓间充质干细胞,差速贴壁法纯化扩增,胰酶+EDTA消化传代。取传至第3代的细胞,按1×104/孔接种于24孔板,置于含两性霉素B、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清的DMEM培养基中向肌细胞方向诱导分化,2周后更换为不含两性霉素B、但添加马血清的DMEM培养基继续培养2周。 主要观察指标：鼠骨髓间充质干细胞形态、表面标志、生长曲线及成肌诱导分化。 结果：原代培养24 h后,鼠骨髓间充质干细胞约80%贴壁生长,第3代细胞多呈梭形,形态比较均一。鼠骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44等间质类细胞的表面分子,不表达CD11B和CD45等淋巴造血细胞的表面分子。接种后第一两天细胞处于潜伏期,第3天细胞增殖旺盛,进入对数生长期,至第4天细胞数增长一倍,第5天进入平台期。两性霉素B诱导后细胞有少量死亡,停用后更换马血清促进细胞成肌,7~10 d可见有肌管样细胞形成,免疫荧光染色可见肌管样细胞呈MHC阳性,DAPI复染后可见肌细胞内有多个细胞核。 结论：在两性霉素B与马血清依次诱导条件下,体外可成功分离培养基因缺陷mdx鼠骨髓间充质干细胞,并证明其具有成肌分化潜能。     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞：最佳诱导剂量筛选☆

背景：目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体。 目的：观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度。 方法：SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50 g/L 3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。 结果与结论：①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25 g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25 g/L为最适诱导剂量。     

人脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

背景：目前所报道的脐带血间充质干细胞体外培养条件不尽相同,尚缺乏统一标准,且培养效率较低。 目的：拟对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-04在中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室完成。 材料：35份脐带血标本来源于北京协和医院妇产科顺产或剖宫产胎儿。 方法：应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分别从脐带血中获得单个核细胞。细胞接种后,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12、L-DMEM和MesencultTM不同培养基,在不同体积分数胎牛血清（5%,10%,20%）、不同细胞接种密度（5×106,1×107,5×107,1×108）下进行细胞培养。细胞传至第3代诱导成骨,行Von Kossa染色。 主要观察指标：不同分离方法、培养基、胎牛血清浓度、种植密度分离培养细胞的效果,脐带血间充质干细胞表面标记的表达及成骨情况。 结果：与淋巴细胞分离液法比较,羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法获得的单个核细胞数量明显增多（P < 0.05,P < 0.01）,羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法细胞原代培养时间显著短于另2种方法（P < 0.01）。应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×107时,培养效率高于其余各种条件组合（P < 0.01）。贴壁细胞表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45,CD90及CD133,经成骨诱导培养21 d后Von Kossa染色可见黑色矿化结节。 结论：应用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法可以获得较多数量的脐带血单个核细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基、细胞接种密度为5×107时可以提高脐带血间充质干细胞的培养效率。     

化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

背景：研究显示干细胞有随环境发生分化即“环境依赖性分化”的特性,但骨髓间充质干细胞在心肌组织是否存在此种特性目前尚未形成公识。 目的：观察化学诱导剂和模拟的生物微环境诱导对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。 设计、时间及地点：随机分组设计,细胞学体外对比观察,于2008-01/2009-02在苏州大学心血管内科干细胞移植实验室完成。 材料：6~8周龄SD大鼠,用于骨髓间充质干细胞的培养;新生1~3 d同种系SD大鼠,用于心肌细胞的培养。 方法：取SD大鼠股骨骨髓,培养至第2代,经流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度97%以上,制成4×108 L-1的细胞悬液,实验分为4组：单纯DMEM培养组：用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养;5-氮杂胞苷组：24 h后培养液内加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷;心肌细胞裂解液组：将4倍于骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞裂解液加入骨髓间充质干细胞培养瓶中;间接接触组：在培养体系中放入millicell插入式细胞培养皿,28 d收获细胞。 主要观察指标：免疫组织化学法检测诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、CD31的情况;RT-PCR法检测各组早期心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、β-肌球蛋白重链及α-肌球蛋白重链基因的表达情况。 结果：免疫组织化学检测显示实验组诱导4周后特异性抗原呈阳性表达,实验组与单纯DMEM培养组相比,差异有显著性意义(P < 0.05);间接接触组较心肌细胞裂解液组阳性细胞数目稍增多,但组间差异无显著性意义(P > 0.05);CD31是血管内皮细胞的表面抗原标志,单纯DMEM培养组和5-氮杂胞苷组无表达,其他两组弱阳性表达,组间差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组诱导4周后,均表达心肌前体细胞特异性转录因子NKX-2.5和GATA4,同时表达胚胎期占优势的心肌细胞特异性β-肌球蛋白重链,而没有表达成年期占优势的心肌细胞特异性标志α-肌球蛋白重链。 结论：5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,心肌细胞裂解液和细胞间接接触模拟的心肌微环境也可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞,分化的细胞介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体。     

脂肪间充质干细胞的分离培养和鉴定

背景：近年来的研究发现,在脂肪组织中也存在这与骨髓间充质干细胞类似的间充质干细胞。脂肪组织可以从美容吸脂中获得,来源丰富,取材方便,蕴藏着巨大的临床应用价值。 目的：分离培养人脂肪间充质干细胞并检测其生物学特性。 方法：用离心的方法获得人脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中行贴壁培养。并进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原。 结果与结论：采用消化、离心分离获得的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞仪检测表明超过90%细胞为CD29、CD45和CD105阳性。提示体外分离培养脂肪间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。 目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。 方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM+体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基(HGM)+体积分数5%胎牛血清;HGM+5%正常大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清+25 μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。 结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。 目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。 设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。 材料：胎龄37~40周的新生儿脐血。 方法：以Ficoll-HyPaque 淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基+体积分数0.1胎牛血清或MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。 主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。 结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。 结论：使用MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。     

不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

背景：骨髓基质干细胞取材方便，增殖力强，具有多向分化潜能，且可自体移植，是组织工程中理想的种子细胞。年龄等因素对骨髓基质干细胞生物学特性的影响鲜见报道。 目的：比较不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的差异，为临床细胞移植提供实验依据。 方法：骨髓基质干细胞供体为SD大鼠。按细胞来源分为3组，即幼年组、成年组和老年组。无菌条件下剪断大鼠股骨两端，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，吹打制成单细胞悬液，通过200目的筛网滤过后将其置于培养瓶中培养。取第2代生长均一的细胞，CD44，CD29，CD90 免疫荧光鉴定；观察细胞形态及黏附速度；细胞计数，绘制生长曲线；MTT法检测3组细胞的增殖活力。 结果与结论：CD44，CD29，CD90免疫染色细胞呈阳性；幼年组骨髓基质干细胞的黏附速度快于成年组和老年组；细胞增殖幅度明显 (P < 0.05)；MTT法测定结果显示幼年组骨髓基质干细胞活力强，与另外两组比较差异具有显著性意义(P < 0.05)。提示幼年SD大鼠骨髓基质干细胞增殖快、活力强、可在短时间内大量扩增，是理想的组织工程细胞。     

小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子保护多巴胺能神经元的实验☆

背景：目前尚未见骨髓间充质干细胞对活化的小胶质细胞特异性反应的报道，且有关骨髓间充质干细胞在特定微环境下如何维持多巴胺能神经元的存活也缺乏相应的实验证据。 目的：观察骨髓间充质干细胞在活化的小胶质细胞刺激下保护多巴胺能神经元存活的作用。 方法：取Wistar大鼠，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，体外培养并活化小胶质细胞，酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。实验分为5组：骨髓间充质干细胞组；小胶质细胞组；脂多糖+小胶质细胞组；骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组；分别取各实验组的培养上清，对中脑多巴胺神经元进行培养。单纯多巴胺能神经元组采用体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12进行培养。采用免疫荧光技术检测不同微环境对多巴胺能神经元存活的影响及不同微环境对骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子的影响。 结果与结论：含有骨髓间充质干细胞的实验组胶质细胞源性神经营养因子的释放量均较相应的对照组高。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现，单纯多巴胺能神经元组神经元的存活率为15%；小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为10%；骨髓间充质干细胞组多巴胺能神经元的存活率为35%；脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为5%；而骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率达到了28%，高于除骨髓间充质干细胞组外的其他各组(P < 0.05)。此外体外培养多巴胺能神经元存活率随培养时间延长下降，但含有骨髓间充质干细胞实验组的多巴胺能神经元存活率明显高于相应对照组。提示小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞上调胶质细胞源性神经营养因子表达，使得多巴胺能神经元免受毒素的损害，抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景: 黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为 神经退行性疾病的治疗提供新的方式。 目的：探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点。 设计：细胞学体外观察。 材料：清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心。黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品。 方法：全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108 L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片。盖玻片上细胞达80%~90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接。免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多。 结论：黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化。 关键词：黄芪;骨髓间充质干细胞;神经干细胞;诱导分化     

脑微血管内皮细胞和脑肿瘤干细胞共培养的体外实验研究

目的 研究体外培养条件下,脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)对脑肿瘤干细胞(braintumor stem cells,BTSCs)增殖、自我更新及分化功能的影响.方法 应用Transwell小室建立BMECs与BTSCs共培养模型,并建立对照组,共培养14 d后,测量肿瘤球(brain tumor sphere,BTS)直径大小,检测BTSCs增殖曲线,测定单细胞克隆形成率.在含血清的培养基中培养10 d后,行CD133、Nestin、GFAP、DAPI免疫荧光染色,计数两组的CD133、Nestin、GFAP染色的细胞数及同一视野的DAPI染色细胞核数,观察两组之间的差异.结果 共培养组BTS直径是对照组的5.05倍,增殖快,共培养组有61.4%能形成下一代BTSCs,而对照组为39.0%.在含血清的培养基中培养10 d后,共培养组的GFAP阳性率较对照组低,而CD133、Nestin阳性率较对照组高.结论 BMECs能够促进BTSCs增殖、自我更新能力,保持BTSCs未分化状态.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向γ-氨基丁酸（GABA）能神经元方向的分化。方法大鼠股骨骨髓分离出BMSCs,培养传代,通过10%胎牛血清（FBS）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）和改良Eagle培养基（DMEM/F12）预诱导24 h,随之加入含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 ng/ml骨形成蛋白-2（BMP-2）和10 ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF）作用48 h后,再以10μmol/L全反式维甲酸（ATRA）培养48 h,最后用40 mmol/L KCl刺激15 min完成诱导分化。对照组用10%FBS和DMEM/F12培养不添加任何诱导因子。形态学观察和Western blot对分化后的细胞进行鉴定分析。结果实验组细胞在形态学上表现出典型的神经元样细胞形态,对照组无明显变化;Western blot分析知实验组Ⅰ和实验组Ⅱ都有分化为GABA能神经元的趋势,但实验组Ⅱ的分化率高于实验组Ⅰ。结论BMSCs可在体外分化为GABA能神经元。     

两种诱导骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化的比较

目的 比较两种体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向γ-氨基丁酸(GABA)能神经元分化的效果.方法 从SD大鼠股骨骨髓中分离出BMSCs,进行培养、鉴定.用两种不同的方法进行诱导,方法一设为对照组:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、全反式维甲酸(ATRA)诱导;方法二设为实验组:ATRA、N5,O2'-二丁酰腺苷3'∶5'-环磷酸(Bt2环磷腺苷)(Bt2CAMP)诱导.对分化细胞进行形态学观察和免疫荧光染色.结果 两组细胞均出现类似神经细胞的形态变化,实验组细胞变化更明显.两组细胞均能表达nestin和GABA 能神经元标记GAD-67,对照组与实验组表达GAD-67的阳性率分别为33.13％±5.12％和41.06％±6.32％,两组相比较具有统计学意义(P＜0.05).结论 实验组定向分化为GABA能神经元的效率高于对照组.