用高效液相色谱技术产前快速诊断β-地中海贫血

目的探讨应用高效液相色谱技术(HPLC)在孕中期快速产前诊断β-地中海贫血(β-地贫)的可行性。方法夫妇双方均为β-地贫基因携带者的孕妇73例,在妊娠19~31w通过经母腹脐静脉穿刺的方法抽取胎血。胎血血红蛋白(Hb)各组分比例的测定采用HPLC,胎血β-地贫基因的检测采用PCR-反向点杂交的方法。结果HPLC检出18例胎血只有HbF而无HbA,PCR-RDB证实此18例胎儿基因型均为β-地贫基因突变纯合子或双重杂合子。剩余55例胎血都有不等量的HbA,其中4例HbA值为0.5%~0.7%,均为带有-28基因突变的双重杂合子;51例HbA值范围1.4%~10.4%,其中30例为β-地贫基因突变杂合子,21例基因型正常。结论对于重型β-地贫,用HPLC测定胎血HbA值和胎儿基因型分析进行产前诊断有很好的相符性。HPLC用在孕中期可以作为产前快速诊断重型β-地贫的一种方法。     

应用悬浮点阵和变性高效液相色谱技术检测β地中海贫血基因的比较

目的比较悬浮点阵技术（suspension array,SA）及变性高效液相色谱技术（DHPLC）在β-地中海贫血及基因分型诊断中的应用。方法通过分析100例正常人标本和69例经PER反向斑点杂交技术（PCR—RDB）确认的β-地中海贫血患者外周血DNA标本,经PCR扩增并分别运用SA及DHPLC两种方法对其进行基因分型诊断。结果100例正常人标本结果为阴性,69例β-地中海贫血标本经两种方法检测其缺失和突变的基因型别完全一致．其中单位点基因突变65例,多位点基因突变4例。结论两种检测技术在β-地中海贫血基因分型诊断中准确性完全一致．具有快速、高效、检测平台的通用性的共同点;但悬浮点阵技术在临床标本检测具有更高的优势,变性高效液相色谱技术则可检测未知突变,在基础研究方面具有优势。     

引物延伸变性高效液相色谱产前诊断β-地中海贫血

目的建立针对中国人常见β-地中海贫血(β-地贫)基因型的产前诊断新方法。方法PCR扩增的靶序列,经引物延伸,得到中国人β-地贫5个常见突变的特异性延伸片段,用全变性高效液相色谱分析延伸片段混合物,分离图谱可鉴定被检样本的基因型。结果盲法分析显示,36个家系108例样品的引物延伸变性高效液相色谱与反向点杂交(reversedotblot,RDB)检测结果符合率为100%。其中6例RDB诊断为上述5个常见突变以外的突变。该法的突变检出率为94.4%(102/108),对产前诊断家庭的诊断率为97.2%(35/36)。结论该法是一种准确、高效的β-地贫突变分析方法,可用于β-地贫的产前诊断。     

高效液相色谱技术检测α地中海贫血价值初探

目的探讨应用高效液相色谱技术(HPLC)快速诊断小儿α地中海贫血(α地贫)的可行性。方法收集经分子生物学方法诊断为α地贫的87例患儿EDTA-K2抗凝血标本2ml,采用HPLC方法测定各血红蛋白组分含量,对α地贫进行非基因检测。结果HPLC检出30例11天至3个月α地贫患儿均有一血红蛋白Bart′s(HbBart′s)峰,14例血红蛋白(HbH)病患儿均有一HbH峰。剩余的43例4个月至11岁标准型或静止型α地贫患儿未检出有任何异常峰。结论HPLC与基因分析对诊断3个月以内的α地贫以及HbH病患儿有很好的符合率。而对于4个月以上的标准型与静止型α地贫患儿无诊断意义。     

β地中海贫血的基因芯片检测

目的 探讨基因芯片诊断β地中海贫血的方法。方法 应用聚合酶链反应及基因芯片分析了我院24份已知基因分型的血液样品。结果 检测到正常个体4例，β地贫20例。包括6种突变类型CDl7(A→T)、IvS2nt-642(C→T)、CD41—42(-TCTT)、TATAbox nt-29(A→G)、TATA box nt-28(A→G)、CD37／N(G→A)。结论 基因芯片法能同时筛查多种β地贫突变，对开展遗传咨询、基因分析及产前诊断具有重要意义。     

海南省1620例地中海贫血基因突变检测分析

目的检测1620例就诊者α,β-地中海贫血的基因,探讨海南地区α,β地中海贫血的基因突变类型特点和频率。方法采用跨跃断裂点PCR（GAP—PCR）技术检测α-地中海贫血（静止型,轻型,中间型）基因变异。PCR-膜反向点杂交技术（RDB）检测B-地中海贫血的17个位点基因变异（41—42M、654M、IVS—I-5M、IntM、-28M、71—72M、17M、BEM、IVS—I—IM、27／28M、43M、-29M、31M、-32M、-30M、14-15M、CAPM）。结果1620例就诊者中地中海贫血基因变异总检出率达到23．46％（380／1620）。其中α-地中海贫血基因突变检出率为17．35％（281／1620）,β-地中海贫血基因突变检出率为6．11％（99／1620）,α,β复合型地中海贫血基因突变的检出率为0．95％（16／1620）。结论海南地区地中海贫血基因突变检出率中α-地贫（17．35％）高于β-地贫（6．11％）,且要重视α,β复合型地中海贫血的基因突变检测,做好婚前地中海贫血筛查和孕检的产前诊断工作,以防重症地贫患儿出生。     

β-地中海贫血修饰基因的研究进展

既往研究表明β-地中海贫血是一种β珠蛋白基因突变导致的单基因遗传病,但是流行病学和遗传学研究发现该病具有显著的遗传学和表型的异质性,提示β-地中海贫血的病因除HBB基因外还涉及其他基因.新近研究提出β-地中海贫血修饰基因的概念,β-地中海贫血修饰基因能影响珠蛋白的表达、合成及稳定性,从而影响了α与非α珠蛋白肽链的平衡.修饰基因及其基因多态性与β-地中海贫血临床表型密切相关,因此β-地中海贫血修饰基因非常值得深入研究,研究成果有助于深入理解β-地中海贫血病因和发病机制,提供更多的潜在治疗靶点,为临床用药、基因治疗和个体化医疗提供指导.     

基于片段长度差异应用HPLC快速检测β-地中海贫血

目的 通过高效液相色谱检测β-地中海贫血常见的基因型.方法 通过多重引物延伸反应同时扩增β-地中海贫血常见的突变位点,基于长度区分不同位点野生型引物和突变型引物扩增产物,并将待检品与标准品检测结果 进行对比,以辨别待检样本的基因型.结果 建立了稳定的高效液相色谱检测点突变技术平台,实现了对β-地中海贫血常见基因型的快速检测,通过对质粒样本、临床病例样本的验证,完全符合质粒样本测序、患者基因组检测的结果.结论 高效液相色谱检测β-地中海贫血具有快速、简便、样品量少等优点,其为遗传病点突变提供了新的检测手段.     

利用反向斑点杂交技术检测β-地中海贫血基因突变

目的探讨反向斑点杂交技术(RDB)在β地中海贫血基因突变检测中的应用,并了解广东顺德地区β地中海贫血基因突变类型及其发生频率.方法应用RDB对48例受检者进行β地中海贫血基因突变检测,并分析其类型及发生频率.结果 161例可疑β地中海贫血患者共检出37例β地中海贫血基因突变,其中包含6种基因突变类型,其发生频率高低排列依次为:CD41/42 21例(43.8%)、IVS-nt654 9例(18.8%)、CD17 9例(18.8%)、TATAnt-28 6例(12.5%)、CD71/72 2例(4.2%)、CD27/28 1例(2.1%).结论 RDB用于β地中海贫血基因诊断效率较高,是目前检测β地中海贫血基因突变的一种较好的方法.研究结果对该地区开展遗传咨询、基因分析及产前诊断具有重要意义.     

利用反向斑点杂交技术检测β-地中海贫血基因突变

目的　探讨反向斑点杂交技术 (RDB)在 β地中海贫血基因突变检测中的应用 ,并了解广东顺德地区 β地中海贫血基因突变类型及其发生频率 .方法　应用RDB对 4 8例受检者进行β地中海贫血基因突变检测 ,并分析其类型及发生频率 .结果　 16 1例可疑 β地中海贫血患者共检出 37例 β地中海贫血基因突变 ,其中包含 6种基因突变类型 ,其发生频率高低排列依次为 :CD4 1/4 2 2 1例 (4 3.8% )、IVS -nt6 5 4 9例 (18.8% )、CD179例 (18.8% )、TATAnt - 2 86例 (12 .5 % )、CD71/72 2例 (4 .2 % )、CD2 7/2 81例 (2 .1% ) .结论　RDB用于β地中海贫血基因诊断效率较高 ,是目前检测 β地中海贫血基因突变的一种较好的方法 .研究结果对该地区开展遗传咨询、基因分析及产前诊断具有重要意义     

应用MOEA技术检测β地中海贫血基因突变

本研究综合应用ＭＯＥＡ及巢式ＰＣＲ等新技术，设计了针对中国人民－β地贫最常见的５种突变的检测方法。运用该技术完成了３７个家系的基因６１条β地贫阳性染色体中，确定了５７条染色体的突变类型检出率达９３．４％，对６例高危胎儿作了产前诊断，并根据结果建议是否继续妊娠，经产后或人工流产后取材验证，结果与产前诊断一致。该技术适合于已知点突变的基因诊断和产前诊断，具有快速、简便、安全、准确等优点，便于临床推广应     

重庆地区β地中海贫血研究

目的 研究重庆地区β地中海贫血的检出率及基因突变类型。方法 采用醋酸纤维薄膜血红蛋白(Hb)电泳、抗碱Hb试验对6436学生进行轻型β地贫筛查及家系追踪调查,并对7例重型β地贫用寡核苷酸探针杂交技术鉴定β地贫基因突变型。结果 筛检出轻型β地贫149人,检出率为2.31％。7例重型β地贫的基因有6种突变类型,其中一种为CaP下游第40-43位核苷酸序列发生缺失(-AA AC)。结论 重庆地区在全国范围内属β地贫高发区之—,7例重型β地贫基因鉴定出6种突变类型,发现一种新的突变类型,提示重庆地区β地贫基因异质性复杂,这可能与重庆地区人口来源的多重性有关。     

β地中海贫血基因治疗的研究进展

基因治疗是根治β地中海贫血研究的重点方向。位点控制区 (L CR)的发现以及新型基因转移系统不断开发研制 ,给导入正常β珠蛋白基因以实现基因治疗的设想带来了希望但同时也产生了新课题 ;与此同时 ,分别从DNA和 RNA水平对受损的β珠蛋白基因进行修正治疗的研究也在开展当中。随着珠蛋白基因表达调控机制研究不断深入 ,同时开发出安全高效的新型病毒载体 ,有可能最终实现β地中海贫血基因治疗     

β地中海贫血的基因芯片检测

目的探讨基因芯片在诊断β地中海贫血中的价值。方法对经筛查初诊的32例β地贫进行基因芯片检测并与斑点杂交法进行比较分析。结果32例β地贫中,基因芯片技术检出32例,斑点杂交法检出30例,两者差别无统计意义(P>0.05)。结论基因芯片技术与斑点杂交法在β地贫的诊断上可以互相代替;基因芯片技术具有快速、高效、自动化等特点且简便、经济、省时省力,较斑点杂交法优越,宜提倡推广应用。     

中国人β地中海贫血的分子基础及产前诊断

β地中海贫血是一组高度异质性的遗传性血液病。中国人中已发现２１种β地贫基因，其突变类型包括碱基替代、小的缺失和插入。我国南方常见的类型是密码子（ＣＤ）４１－４２（－ＴＣＴＴ）移码突变，ＩＶＳ２ｎｔ６５４（Ｃ→Ｔ）突变，ＣＤ１７（Ａ→Ｔ）突变，ＴＡＴＡ盒ｎｔ－２８（Ａ→Ｇ）突变和ＣＤ７１－７２（＋Ａ）移码突变，其基因频率分别为４１．６％、２１．８％、１８．０％和８．０％及３．９％。     

一个β地中海贫血复合δβ地中海贫血家系的表型与基因型分析

目的：调查一种缺失型δβ地中海贫血（简称地贫）基因型与表型的关系,探索进行β地贫复合该缺失型突变高风险胎儿的快速产前诊断方法。方法：以表型和基因分型进行家系分析。表型分析采用红细胞指标和血红蛋白电泳分析;用跨越断裂点的三引物聚合酶链反应直接分析法检测δβ地贫缺失突变;用反向点杂交技术筛查β地贫基因突变;并对一例该型地贫高风险胎儿进行了产前基因诊断。结果：先证者（重症地贫）为一种缺失型δβ地贫与β地贫双重杂合子,其δβ地贫基因遗传自母方,在该家系3代9名成员中共检测到4例携带了这一基因,其表型和基因型结果相互吻合;β地贫基因（密码子41－42－CTTT移码突变）遗传自父方。对该家系的重症地贫高风险胎儿进行产前基因诊断的结果显示,胎儿的基因型完全正常。结论：在国内首次报告由缺失型δβ地贫基因与β地贫移码突变双重杂合导致的重平地贫高风险胎儿的产前诊断结果。采用的技术简便、快速,可用作同类事件的参考。     

一个少见的β地中海贫血突变家系

目的　鉴定中国人中 1个少见的 β地中海贫血 (β-地贫 )家系成员的基因转录突变 (- 90C→ T)。　方法　表型分析采用常规的红细胞指数和血红蛋白电泳分析技术 ;反向点杂交技术用于检测中国人 18种已知类型的β-地贫突变 ;β珠蛋白基因全长 DNA测序技术用于确定样品的基因突变及其基因型 ;RT- PCR半定量法分析该突变对 β-珠蛋白基因转录水平的影响。　结果　家系分析发现 :先证者、先证者之兄和其母亲为有典型 β-地贫特征的个体 ,反向点杂交筛查未发现已知的 β-地贫突变 ,DNA直接测序分析发现该家系的这 3个成员均携带有 1种中国人中未见报道的 β地贫等位基因—— β-珠蛋白基因启动子区近侧 CACCC盒中 - 90位的 C→ T转录突变。RT- PCR分析显示该突变引起β-珠蛋白基因转录水平下降 (突变 :2 .2 33± 0 .0 1vs正常 :3.779± 1.19;95 % CI:3.0 6 0 ,4 .4 99) ,与其他类型的β-地贫杂合子β-基因的表达水平相当 (2 .110± 0 .5 3,95 % CI:1.732 ,2 .4 88)。　结论　 - 90位的 C→ T转录突变是中国人中未见报道的稀少类型的 β-地贫转录突变。     

β-地中海贫血的临床实践指南

β-地中海贫血(比地贫)为常染色体隐性遗传病,也是分子基础被最早阐明的单基因遗传病之一。该病主要分布于包括我国南方地区在内的热带和亚热带地区。重型β-地贫患儿出生时无明显症状,但发病后常因严重贫血且缺乏有效的治疗于幼儿期死亡。本病可通过产前诊断阻止受累患儿的出生。严重贫血的患者可借助终生规范输血和除铁治疗长期生存,造血干细胞移植可以治愈该病,基因治疗也展现出良好的应用前景。本文基于中国人群的表型和遗传突变数据,聚焦于对β-地贫的临床诊断和遗传咨询进行阐述,并概述了该病临床治疗和人群预防的要点,旨在为临床医师及实验室人员提供指导实践的规范性文本,提高β-地贫的临床诊治水平。     

高效液相色谱法诊断地中海贫血的阈值探讨

目的探讨高效液相色谱法(HPLC)诊断地中海贫血的HbA;2和HbF最佳阈值,提高HPLC诊断地贫携带者特异性,减少漏诊与误诊。方法病例组收集平均红细胞体积(MCV)≤82fl和/或平均红细胞血红蛋白含量(MCH)≤26pg的EDTA;2K2抗凝血2272份;对照组收集MCV>82fl,MCH>26pg抗凝血1903份。用HPLC方法测定血红蛋白亚型HbA;2和HbF含量;对HbA;2≤2.5%血样进行α地中海贫血常见缺失型基因检测,对HbA;2≥3.5%和/或HbF≥2.3%血样采用反向点杂交(RDB)法进行CD41-42M,-28M,IVS-2-654M,CD71-72M等17种常见突变基因检测。结果当HbA;2≤2.5%,α地贫携带者检出率为90.73%(460/507);HbA;2>2.5%,α地贫携带者检出率为47.03%(830/1765),两组差别有统计意义(P<0.001),与对照组差别有统计意义。当HbA;2≥3.8%时,HPLC诊断β地贫的灵敏度和特异度最佳,常见突变型β地贫携带者的检出率为99.08%(536/541);当HbF≥2.3%时,常见突变型β地贫携带者的检出率仅为4.00%(1/25);当HbA;2≥3.8%结合HbF≥2.3%时,检出率98.78%(163/165),三组间比较差别有统计意义(P<0.001)。结论 HPLC是诊断β地贫的有效方法。HbA;2≥3.8%且HbF≥2.3%为HPLC诊断β地贫的最佳阈值,HPLC诊断β地贫敏感度与特异度的综合评价性能最理想。     

单细胞水平β地中海贫血基因突变检测技术的实验研究

目的探讨在单个淋巴细胞水平能否同时检测β地中海贫血多个突变.方法将我国β地中海贫血常见8种突变点(CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、TATA box nt -28、CD71-72、TATA box nt -29、CD26、IVS-Ⅰ-5)的等位特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleiotide,ASO)探针点样于尼龙膜上,制备β地中海贫血常见突变诊断膜条.应用蛋白酶裂解法处理单个细胞,采用15个碱基的随机引物对单个细胞的基因组进行引物延伸预扩增(primer extension preamplification,PEP),取其产物5μl分别对β地中海贫血的目的基因片段进行巢式或半巢式PCR扩增与生物素标记,然后采用β地中海贫血常见突变诊断膜条与标记产物进行反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)检测β地中海贫血突变型.结果使用显微操作法分别从1例正常女性及4例β地中海贫血血标本中获得3个淋巴细胞.采用Rechitsky等的蛋白酶K裂解法处理单个淋巴细胞,扩增效率为93.3%,等位基因脱扣率为6.7%.RDB杂交后结果显示与预料的相符,其基因型依次为N/N、CD17(A→T)/N、IVS-Ⅱ-654(C→T)/CD17(A→T)、CD41-42(-CTTT)/N、TATA box nt -28(A→G)/N.结论在单细胞水平应用PEP及RDB技术可以同时检测β地中海贫血多个突变,操作相对简便,为胚胎植入前遗传学诊断和无创性产前诊断的应用提供了新的检测方法,有较好的临床应用前景.