鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌基因鉴别方法的建立及评价

目的 建立鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌基因鉴别方法。方法 依据鼠疫菌、假结核菌特有的基因组序列["疫岛(PeI)"和"假岛(PsI)"], 与已公布的12株鼠疫菌和4株假结核菌全基因序列进行比对, 设计特异性的引物, 对鼠疫菌、假结核菌和其他肠道细菌进行鉴定。结果 用52株鼠疫菌、57株假结核菌和其他肠道菌株进行验证, 结果显示, 5对鼠疫菌的鉴定引物中, 2对(PeI2和PeI11)仅在52株鼠疫菌中扩出目的条带, 另3对引物(PeI1、PeI3和PeI12)除鼠疫菌外在部分假结核菌株中也扩出目的条带;5对假结核菌鉴定引物中, 1对引物(PsI1)在52株鼠疫菌和57株假结核菌株中扩出目的条带, 4对引物(PsI7、PsI16、PsI18和 PsI19)仅在57株假结核菌株中均扩出目的条带, 在鼠疫菌中未扩出目的条带。结论 用鼠疫菌和假结核菌共有的PsI1序列、鼠疫菌特有的PeI2和PeI11序列及假结核菌特有的PsI7、PsI16、PsI18和 PsI19序列组成的基因鉴别方法, 可以用于鼠疫菌和假结核菌的基因快速鉴别。     

HRP-F1McAb酶免疫染色技术检测小鼠脏器鼠疫F1抗原应用效果评价

目的：评价辣根过氧化酶标记鼠疫F1单克隆抗体（HRP‐F1McAb）酶免疫染色技术检测小鼠脏器鼠疫F1抗原的应用效果。方法通过HRP‐F1McAb酶免疫染色法检测鼠疫菌EV株感染小鼠脏器标本和对照小鼠脏器标本,同时用细菌学、RIHA和ELISA做平行检测。结果 HRP‐F1McAb酶免疫染色法与细菌学一致率为96．36％,阳性检出率差异无统计学意义（χ2＝0,P＞0．05）;HRP‐F1McAb酶免疫染色法和RIHA一致率为98．18％,阳性检出率差异无统计学意义（χ2＝0,P＞0．05）;HRP‐F1McAb酶免疫染色法和ELISA一致率为96．36％,阳性检出率差异无统计学意义（χ2＝0,P＞0．05）。结论酶免疫染色法检测小鼠脏器鼠疫F1抗原特异敏感、简单快速。     

双抗原夹心ELISA检测鼠疫F1抗体技术的应用

目的研究双抗原夹心酶联免疫吸附试验（DAgS—EusA）检测鼠疫F1抗体技术在鼠疫监测中的实用性。方法用DAgS—ELISA和间接血球凝集试验（IHA）微量法对比检测558份标本鼠疫F1抗体。结果IHA检测出阳性33份,DAgS—ELISA检出阳性31份,阳性符合率为90．91％,阴性符合率99．81％,总符合率99．28％,二者检出阳性率分别为5．91％和5．56％,差异无统计学意义（X^2=0．25,P=0．625）。2种方法测定27份鼠疫免疫血清均阳性,IHA微量法的敏感性高于DAgS—ELISA（t=3．023,P=0．006）。结论DAgS—ELISA检测鼠疫F1抗体敏感性低于IHA微量法,但特异性好,无前滞反应,可避免初筛漏检问题。     

生物传感器与鼠疫耶尔森菌检测

生物传感器由于具有轻巧和灵敏度高的特点，可能会在微生物检测中发挥重要作用。尽管目前由于微生物检测的商品化传感器还十分稀少，但是一个值得探讨的发展方向。鼠疫作为一种典型的人兽共患病广泛分布在全世界，其病原鼠疫耶尔森菌的检测因此显得尤为重要。本综述了光纤传感器、不寻址电位传感器和平面波导传感器在鼠疫耶尔森菌检测中的应用，介绍了各传感器原理与特点，并对灵敏度和特异性进行了讨论。     

鼠疫耶尔森菌rRNA基因识别特征研究

目的 分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的rRNA基因识别特征.方法 通过比较基因组学方法,利用Clustal W软件,对目前已完成全基因组测序的9株鼠疫菌的rRNA基因序列进行分析,分别比对rRNA基因簇两侧的2000bp序列、基因簇内16S、23S、5S rRNA及16S～23S基因间隔区序列,以确定鼠疫菌rRNA基因的识别特征.结果 菌株D182038、D106004、Z176003和CO92分别有6个rRNA基因簇拷贝(6拷贝菌株),菌株91001、KIM、Nepa1516、Antiqua和Pestoides F分别有7个rRNA基因簇拷贝(7拷贝菌株).按照两侧2000bp序列不同,可将鼠疫菌rRNA基因簇分成13种类型,并可将6拷贝与7拷贝菌株进行区分;16S～23S rRNA基因间隔区含有4种不同种类和数量的tRNA基因,可将6拷贝菌株和7拷贝菌株分别进行区分;23S rRNA基因在不同菌株间及不同rRNA拷贝间的碱基突变数方差分析显示,各菌株间F=0.548,P=0.815>0.05;各拷贝间F=5.228,P<0.01.结论 鼠疫菌rRNA基因簇两侧序列、间隔区tRNA基因和23S rRNA基因可作为识别不同菌株和不同rRNA基因簇拷贝的指标,将鼠疫菌不同菌株进行分类.

Abstract：

Objective To study the identification characteristics of rRNA genes on Yersinia (Y.)pestis.Methods By means of comparative genomics,we compared the rRNA genome sequences of nine completely sequenced strains of Y. pestis isolated from China and other countries by Clustal W software.we also compared the 2000 bp sequence adjacent to the rRNA genes,rRNA genes and 16S-23S rRNA spacer region respectively to determine the identification features of rRNA genes for Y. pestis.Results There were 6 rRNA gene clusters in the strains of D182038,D106004,Z176003 and CO92 respectively(6 copies strain).There were 7 rRNA gene clusters in the strains of 91001,KIM,Nepa1516,Antiqua and Pestoides F(7 copies strain).According to the 2000 bp sequence,13 types of rRNA gene clusters could classify the strains between the 6 copies and 7 copies.There were 4 types of tRNA gene among the 16S-23S rRNA spacer region that could classify the strains among the 6 copies and 7 copies strains respectively.The number of point mutation among the 23S rRNA gene was statistically different in some copies under ANOVA analysis(F=0.548,P=0.815>0.05 among the strains and F=5.228,P<0.01 among the copies).Conclusion The 2000 bp sequence adjacent to the rRNA genes,tRNA gene and 23S rRNA gene sequence could serve as the identification sign of rRNA genes for classifing the strains of Y. pestis.     

鼠疫耶尔森菌检测方法的研究进展

鼠疫（Plague）是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia Pestis）引起的人畜共患的烈性传染病之一。自1894年耶尔森和北里2位学者成功分离和鉴定出鼠疫耶尔森菌以来，人们己成功地建立起常规的病原学和血清学检测方法。随着分子生物学技术的飞跃发展，鼠疫菌检测技术正发生着日新月异的变化。现就近年来鼠疫耶尔森氏菌检测的研究进展作一综述。     

聚合酶链反应方法检测鼠疫耶尔森菌的内部对照研究

目的 避免聚合酶链反应(PCR)方法检测鼠疫菌发生假阴性。方法 通过克隆，将16srRNA引物的扩增产物与鼠疫菌F1抗原基因克隆子相连，并以其作为内部对照模板进行PCR试验。结果 得到了在包含F1抗原基因中连接有16SrRNA扩增产物的质粒，并初步确立了作为内部对照质粒的参照标准浓度。结论 在采用PCR方法检测鼠疫菌时，加入适宜浓度的内部对照质粒作为模板与待检样品同时扩增，可避免假阴性的发生。     

鼠疫耶尔森菌检测技术研究进展

鼠疫(plague)是由鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)引起的自然疫源性疾病,其传染性强,传播速度快,病死率高,被列为甲类传染病之首[1].鼠疫在历史上曾有过3次大流行,罹难者数以亿计.为了防止鼠疫的大面积的流行,维护社会的生命和财产安全,对鼠疫的快速诊断提出了更高的要求.如今,新技术新手段的应用,为有效的控制鼠疫的传播和流行提供了保障.本文对鼠疫检测技术和方法进展进行综述.     

鼠疫耶尔森菌caf1基因的克隆表达及其产物免疫学评价

目的 表达具有免疫学活性重组F1抗原(rF1),并以其构建检测鼠疫抗体胶体金试纸条.方法 将去掉信号肽编码序列的caf1基因片段与载体质粒pET32a(+)通过BamHI和Not I双酶切位点进行连接,将重组质粒[caf1-pET32a(+)]转化入BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经亲和层析纯化,以纯化rF1及天然F1抗原制备双检测鼠疫抗体胶体金标试纸条,并对浙江省528份人血清标本进行检测.结果含caf1-pET32a(+)的BL21(DE3),经诱导产生相对分子质量(M_r)约为35.5×10~3的rF1融合蛋白;rF1融合蛋白检测鼠疫抗体的敏感性等同甚至超越天然F1抗原;在528份人血清标本的检测中,rF1与天然F1的符合率为97.9%(K=0.466),有较好一致性.结论 制备的rF1,具有良好免疫学活性,该rF1可替代天然F1抗原,用于鼠疫免疫学检测.     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.     

胶体金免疫层法在鼠疫监测中应用效果评价

目的 了解胶体金免疫层析法在鼠疫监测中的作用及其优劣.同时观察56℃30 min灭活与升汞盐水作用1 min对鼠疫菌F1抗体检测的影响.方法 对2006年从广西隆林县、西林县鼠疫监测中收集的鼠脏器、鼠血清以及既往鼠疫抗体阳性患者血清,利用胶体金免疫层析技术进行鼠疫菌F1抗原(脏器)与F1抗体(血清)检测.结果 鼠肝脏120份、鼠脾脏99份,胶体金法检测鼠疫菌Fl抗原均为阴性;鼠血清235份胶体金法检测鼠疫菌F1抗体为阴性、既往鼠疫阳性病人27例,胶体金检测鼠疫菌Fl抗体灭活组阳性2例,阳性率为7.41%(2/27),升汞组均为阴性.结论 升汞对鼠疫菌F1抗体的检测有抑制作用;胶体金免疫层析法具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速等优点,在鼠疫监测中具有重要意义.     

鼠疫监测中胶体金免疫层析法的应用效果评价

目的 了解胶体金免疫层析法在鼠疫监测中的作用及其影响因素.方法 对2006年自广西隆林县、西林县鼠疫监测中收集的鼠脏器、鼠血清以及既往鼠疫阳性病人血清,利用胶体金免疫层析技术进行鼠疫菌F1抗原(脏器)与F1抗体(血清)检测.结果 鼠肝脏120份、鼠脾脏99份,胶体金法检测鼠疫菌F1抗原均为阴性;鼠血清235份胶体金法检测鼠疫菌F1抗体为阴性、既往鼠疫阳性病人27例胶体金检测鼠疫菌F1抗体灭活组阳性2例,阳性率为7.41%(2/27),升汞组均为阴性.结论 升汞对鼠疫菌F1抗体的检测有抑制作用;胶体金免疫层析法具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速等优点,在鼠疫监测中具有重要的流行病学意义.     

4种鼠疫F1抗原/抗体检测方法的初步评价

目的 客观评价血凝试验、胶体金试验、ELISA和PCR 4种检测方法的灵敏性.方法 对于血清学方法中的F1抗体检测,评价检出的全菌免疫兔抗血清最低稀释度;F1抗原检测,评价检出的最低浓度.对于分子生物学方法,评价同时检出fra基因和pla基因的模板最低浓度.结果 对于F1抗体检测,间接血凝试验检出的最低稀释度是1:64,胶体金试验是1:1000,ELISA是1:204 800.对于F1抗原检测,反向血凝试验检出的最低浓度是2 ng/ml,胶体金试验是50 ng/ml.fra、pla基因同时检出,模板的最低浓度是0.21 ng/μl.结论 在以抗体IgG为主的血清中,ELISA法对于F1抗体检测的灵敏性较高.反向间接血凝试验对于F1抗原检测的灵敏性较高.为减少误诊率,采用PCR诊断鼠疫菌要求最低模板浓度是0.21 ng/μl.     

染疫啮齿动物皮鼠疫菌存活时间和再感染能力的研究

实验感染啮齿动物,鼠疫菌在自然干燥皮上存活时间为1～7天,在足上活存时间为1～11天;在盐拌组皮上存活时间为0天,足上为1～5天。自然干燥组和盐拌组比较,鼠疫菌在皮上存活时间有显著差异,在足上存活时间无显著差异。保持再感染的时间,自然干燥皮块为0～7天,足为0～9天;盐拌组皮块24小时即失去对小白鼠的再感染力,足则保持1～5天。讨论认为,鼠疫菌在市售獭皮的皮面和足内存活时间无显著差异,盐拌处理可使皮上鼠疫菌存活时间缩短。     

鼠疫菌在市售獭皮上存活时间的研究

本文对市售獭皮的分类、单位面积带菌量、EV菌在市场獭皮上的存活时间及其与温、湿度变化的关系进行了研究。根据獭皮皮面有无脂肪,将獭皮分为干皮和脂皮。干皮单位面积平均带菌量为60.6万个菌/cm~2,鼠疫菌存活时间最长21天,最短14天,平均16.6天,与温、湿度变化呈明显的负相关关系;脂皮单位面积平均带菌量为715个菌/cm~2,鼠疫菌存活时间最长3天,最短0天,平均1.8天,与温、湿度变化无明显的相关关系。     

中国鼠疫自然疫源地分型研究Ⅳ.鼠疫耶尔森菌生物型生物学特征的探讨

鼠疫菌生物型是鼠疫菌起源进化遗传性状最稳定的生物学标准, 是鼠疫起源进化普系的“活化石”, 也是该菌起源进化最具代表性的模式.依据其对甘油和阿拉伯糖的酵解和还原硝酸盐的能力, 鼠疫菌可分为4种生物型, 即古典型(甘油酵解阳性, 阿拉伯糖酵解阳性, 硝酸盐还原阳性)、中世纪型(甘油酵解阳性, 阿拉伯糖酵解阳性, 硝酸盐还原阴性)、东方型(甘油酵解阴性, 阿拉伯糖酵解阳性, 硝酸盐还原阳性)和田鼠型(甘油酵解阳性, 阿拉伯糖酵解阴性, 硝酸盐还原阴性).前三种生物型与人类历史3次鼠疫大流行相对应, 最后一种生物型对人不致病, 但能造成田鼠鼠疫并在其自然疫源地内流行.目前中国鼠疫自然疫源地有4种鼠疫菌生物型.     

内蒙古自治区不同生态系鼠疫自然疫源地动物鼠疫流行现状及流行风险简析

内蒙古面临着多种类型疫源地鼠疫流行和复燃的风险。蒙古旱獭疫源地虽然暂未在国内发现动物间鼠疫流行,但过去检出过阳性血清,同时蒙古旱獭种群数量持续增加且分布范围不断扩大,毗邻的蒙古国和俄罗斯联邦的蒙古旱獭疫源地动物间鼠疫持续流行;达乌尔黄鼠疫源地动物间鼠疫时隐时现;长爪沙鼠疫源地动物间鼠疫流行猛烈,并频频波及人间。由于蒙古旱獭和达乌尔黄鼠鼠疫耶尔森菌菌株毒力明显高于长爪沙鼠鼠疫耶尔森菌菌株,且在历史上曾给当地带来深重灾难,因此内蒙古自治区鼠疫防控重点应在常规鼠疫监测的基础上,进一步加强蒙古旱獭和达乌尔黄鼠疫源地流行动态的监测,警惕该两个疫源地复燃并波及人间。     

内蒙古自治区不同生态系鼠疫自然疫源地动物鼠疫流行现状及流行风险简析

内蒙古面临着多种类型疫源地鼠疫流行和复燃的风险。蒙古旱獭疫源地虽然暂未在国内发现动物间鼠疫流行,但过去检出过阳性血清,同时蒙古旱獭种群数量持续增加且分布范围不断扩大,毗邻的蒙古国和俄罗斯联邦的蒙古旱獭疫源地动物间鼠疫持续流行;达乌尔黄鼠疫源地动物间鼠疫时隐时现;长爪沙鼠疫源地动物间鼠疫流行猛烈,并频频波及人间。由于蒙古旱獭和达乌尔黄鼠鼠疫耶尔森菌菌株毒力明显高于长爪沙鼠鼠疫耶尔森菌菌株,且在历史上曾给当地带来深重灾难,因此内蒙古自治区鼠疫防控重点应在常规鼠疫监测的基础上,进一步加强蒙古旱獭和达乌尔黄鼠疫源地流行动态的监测,警惕该两个疫源地复燃并波及人间。     

随机扩增多态性DNA技术用于鼠疫耶尔森氏菌基因分型的研究

目的 对来自全国不同疫源地、不同生态型的１０３株鼠疫耶尔森氏菌进行基因分型研究。方法 用随机扩增多态性ＤＮＡ技术（ＲＡＰＤ）。结果 将鼠疫耶尔森氏菌分成两种基因型别：全国大部分菌株为ＲＡＰＤ－１型,青海省境内的大部分菌株为ＲＡＰＤ－２型。结论 不同生态型的鼠疫耶尔森氏菌基因结构存在差异,为鼠疫耶尔森氏菌的基础研究和防治提供依据。