重组腺病毒介导hCGPx转染致血管内皮细胞产生抗氧化损伤作用的研究

目的 研究重组腺病毒介导的人胞浆型谷胱甘肽过氧化物酶（hCGPx）转染对血管内皮细胞ECV304氧化损伤保护作用。方法 将含hCGPx cDNA的质粒pGEM-T-hCGPx和重组腺病毒载体pACCMV-pLpA穿梭质粒进行基因重组,构建成pACCMV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建成重组腺病毒AdCMV-hCGPx。用AdCMV—hCGPx转染体外培养的ECV304细胞并分为转染24、48和72h组,以转染空载体的细胞为对照组,检测转染细胞的基因表达水平。各组ECV304细胞经H2O2氧化损伤处理后,分别对细胞的活力和凋亡进行检测分析。结果 各转染组细胞转染基因表达率均显著高于对照组（P〈0．01）。经H2O2氧化损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞活力较对照组明显增强,凋亡受到抑制。结论 重组腺病毒介导的hCGPx转染可保护ECV304细胞抵抗氧化损伤,具有明确的细胞保护作用,其具体保护机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。     

腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用。结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布于心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MT...     

去甲肾上腺素诱导热休克蛋白70保护心肌细胞的机制

目的探讨去甲肾上腺素预处理心肌细胞后诱导心肌热休克蛋白70(HSP70)的表达及其对心肌细胞保护作用机制。方法 Wistar大鼠乳鼠心肌细胞培养,分为3组:对照组:心肌培养3～5天未施加任何因素;缺氧/复氧组:心肌细胞培养3～5天后,模拟缺氧(加入饱和氮气pH 6.8 D-Hank’s液培养细胞)3 h,复氧(用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞)孵育6 h;去甲肾+缺氧/复氧组:模拟缺氧前30 min加入100 nmol/L去甲肾,其它同缺氧/复氧组。测定心肌HSP70和bcl-2以及相关的细胞凋亡指标。结果 HSP70和bcl-2的表达在去甲肾+缺氧/复氧组明显高于缺氧/复氧组,去甲肾+缺氧/复氧组的细胞凋亡率明显低于缺氧/复氧组。结论去甲肾上腺素预处理可能通过诱导心肌组织HSP70和bcl-2高表达,发挥其对供心的保护作用。     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的改变

目的 :探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白 70表达的影响。方法 :第 2代培养心肌细胞随机分为正常对照组 (C组 )、缺氧 /复氧组 (A/R组 )、缺氧预适应组 (IP组 )和七氟醚预适应组 (S组 ) ,每组均缺氧 2h ,复氧 48h。分别取复氧 0 ,1,12 ,2 4,36和 48h的细胞 ,用免疫组化染色检测HSP70 表达并进行图象分析。结果 :在各个时间点 ,S组和IP组间的HSP70 表达均显著高于A/R组和C组 (P <0 .0 1) ,A/R组的HSP70 表达略高于C组 ,S组和IP组间的HSP70 表达差异无显著性 (P >0 .0 5 )。随着复氧时间的延长 ,S组和IP组间的HSP70 表达从 1h开始增加 ,2 4h表达最强 ,与 1h相比差异具有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70 在延迟相呈高表达 ,提示HSP70 参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP—70表达的改变

目的：探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白70表达的影响。方法：第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(A／R组)、缺氧预适应组(IP组)和七氟醚预适应组(S组)，每组均缺氧2h，复氧48h。分别取复氧0，1，12，24，36和48h的细胞，用免疫组化染色检测HSP70表达并进行图象分析。结果：在各个时间点，S组和IP组间的HSP70表达均显著高于A／R组和C组(P＜0．01)，A／R组的HSP70表达略高于C组，S组和IP组间的HSP70表达差异无显著性(P＞0．05)。随着复氧时间的延长，S组和IP组间的HSP70表达从1h开始增加，24h表达最强，与1h相比差异具有显著性(P＜0．05)。结论：七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70在延迟相呈高表达，提示HSP70参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

GDNF基因修饰的BMSCs对大鼠缺氧复氧神经细胞凋亡的实验研究

目的 研究腺病毒介导的外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达及其对缺氧复氧神经细胞凋亡的影响.方法 将GDNF基因重组腺病毒感染大鼠BMSCs,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测外源性GDNF基因在BMSCs中的表达水平;将GDNF基因修饰的BMSCs与缺氧复氧神经元共培养,观察神经细胞的凋亡情况.结果 GDNF基因感染组在感染后3～12 d能稳定表达GDNF蛋白,空质粒载体感染组和未感染组基本上无GDNF蛋白的表达;与BMSCs共培养组相比,BMSCs/GDNF分泌的GDNF能显著降低缺氧复氧神经细胞的凋亡率(复氧12 h至5 d,P<0.05).结论 腺病毒介导的基因感染技术能够有效地将GDNF基因转至BMSCs中,表达和分泌有生物学活性的GDNF蛋白,这为进一步研究GDNF基因修饰的BMSCs应用于中枢神经系统疾病的治疗研究奠定了基础.     

还原型辅酶I对缺氧复氧诱发大鼠脑皮层神经元凋亡的保护作用

目的通过建立大鼠脑皮层神经元缺氧复氧模型,探讨还原型辅酶Ⅰ(reduced nicotinamide adenine dinu-cleotide,NADH)对缺氧复氧诱发神经元凋亡的保护作用。方法原代培养新生大鼠脑皮层神经元,随机分成正常对照组,缺氧复氧组和NADH组。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡,计算凋亡率,检验各试验组细胞凋亡率的差异。用透射电镜观察凋亡细胞超微结构。结果正常对照组各阶段细胞凋亡率间差别无统计学意义(P0.05)。缺氧复氧组和NADH组凋亡率均较正常对照组调亡率大,差异有统计学意义(P0.01),缺氧复氧组较NADH组凋亡率大,差异有统计学意义(P0.01)。在复氧12 h内给予NADH,对于神经元凋亡抑制作用优于其余复氧时间点。结论缺氧复氧可诱发体外培养神经元发生凋亡,NADH对此有明显抑制作用。在复氧12 h内给予NADH对凋亡的抑制作用较明显。     

HSP70对严重烧伤大鼠保护作用的实验研究

目的寻找对严重烧伤早期缺血缺氧性损伤的可行性保护途径.方法构建含HSP70的重组腺病毒载体,股静脉注射该腺病毒载体48 h后,检测大鼠严重烧伤后6 h其血清中内毒素及LDH、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子水平.结果未转染组大鼠严重烧伤后6 h血清中内毒素及检测的细胞因子水平较正常对照组明显升高.静脉注射含HSP70重组腺病毒组大鼠严重烧伤后血清中上述指标的检测水平与未转染组比较明显降低,但仍显著高于正常对照组.结论静脉注射含HSP70重组腺病毒可减轻严重烧伤后大鼠的缺血缺氧性损伤,但不能完全阻断该损伤.     

vAd-HSP70表达对低氧-复氧损伤后神经细胞生长影响

目的 探讨重组腺病毒介导的热休克蛋白70 (HSP70)表达对低氧-复氧损伤后神经细胞生长的影响.方法 用携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70感染体外原代培养的神经细胞,RT-PCR和Wes-tern blotting方法 检测靶细胞中外源性HSP70基因表达.实验分为vAd-HSP70感染组、vAd-...     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的改变

目的探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白70表达的影响.方法第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(A/R组)、缺氧预适应组(IP组)和七氟醚预适应组(S组),每组均缺氧2 h,复氧48 h.分别取复氧0,1,12,24,36和48h的细胞,用免疫组化染色检测HSP70表达并进行图象分析.结果在各个时间点,S组和IP组间的HSP70表达均显著高于A/R组和C组(P＜0.01),A/R组的HSP70表达略高于C组,S组和IP组间的HSP70表达差异无显著性(P＞0.05).随着复氧时间的延长,S组和IP组间的HSP70表达从1 h开始增加,24 h表达最强,与1 h相比差异具有显著性(P＜0.05).结论七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70在延迟相呈高表达,提示HSP70参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相.     

HSP70基因静脉注射对严重烧伤大鼠肠粘膜保护作用的实验研究

目的 为严重烧伤后肠粘膜损伤的防治提供可行性的基因治疗途径。方法 大鼠静脉注射含HSP70基因的重组腺病毒载体，通过严重烧伤后肠粘膜病理形态学改变、损伤指数统计及血清中乳酸脱氢酶含量的变化观察基因转染后保护效应。结果 静脉转染HSP70基因的大鼠烧伤后肠粘膜组织病理改变较单纯烧伤组减轻，损伤指数明显降低，血清中乳酸脱氢酶含量明显下降。结论 大鼠静脉注射含HSP70基因的重组腺病毒载体可保护严重烧伤后肠粘膜的缺血缺氧性损伤。为严重烧伤早期缺血缺氧性损伤的防治提供可行性的基因治疗途径。     

多囊蛋白1基因对人宫颈癌HeLa细胞的抗凋亡作用

目的：研究多囊蛋白1（PC1）对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,为进一步阐明PC1对凋亡的作用提供依据。方法：采用PC1基因重组质粒pEGPF-PC1-5TMC和空白对照质粒pEGFP分别转染HeLa细胞,Western blotting法进行验证。采用MTT法分别检测转染组（转染PC1重组质粒）、空白对照组（转染空白对照质粒pEGFP）和正常对照组（正常HeLa细胞）转染后48和72 h时细胞增殖活性,采用TUNEL法检测转染组和空白对照组细胞凋亡率。结果：转染后48和72 h,与正常对照组比较,转染组细胞增殖活性差异无统计学意义（P>0.05）;与空白对照组比较,转染组细胞增殖活性明显升高（P<0.05）。转染组细胞凋亡率明显低于空白对照组（P<0.01）。结论：PC1基因对人宫颈癌HeLa细胞有抗凋亡作用。     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞生长因子受体-2基因表达及其意义的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)抑制卵巢癌细胞表皮生长因子受体-2(HER-2)基因的表达及其细胞效应。方法实验分为以下3组空白对照组(未经转染的人卵巢癌SKOV-3细胞)、转染非特异性的siRNA组及转染特异性的siRNA组。干涉后5d加顺铂。采用半定量PCR技术(RT-PCR)和Western印迹法检测HER-2mRNA和蛋白的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞对顺铂的化学敏感性的变化,分析观察细胞生物学特性的改变。结果HER-2siRNA对HER-2mRNA表达明显抑制,作用能持续10d左右;干涉第7天后开始出现蛋白质表达的明显减弱,转染特异性siRNA组的蛋白质阳性表达率为(25·5±0·8)%,非特异性siRNA组为(95·7±0·8)%,空白对照组为(96·6±1·2)%,前组与后两组比较差异有统计学意义(均P<0·001)。干涉后随着HER-2mRNA表达下降,细胞凋亡增加,第6天凋亡率最高,达(53·2±1·0)%,转染非特异性siRNA组为(4·1±0·3)%,空白对照组为(4·1±0·3)%,差异有统计学意义(P<0·001);干涉后,转染特异性siRNA组的细胞存活率为(58·4±0·8)%,转染非特异性siRNA组为(68·0±0·6)%,空白对照组为(67·0±0·3)%,前组与后两组比较差异有统计学意义(均P<0·001)。结论体外合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2表达,促进细胞的凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性,RNAi为卵巢癌的基因治疗提供了一种新策略。     

Effects of HSP70 antisense oligonucleotide on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells

The study investigated the effects of heat shock protein 70(HSP70) antisense oligonucleotide(ASODN) on the proliferation and apoptosis of a human hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721 cells) in vitro.HSP70 oligonucleotide was transfected into SMMC-7721 cells by the mediation of SofastTM transfection reagent.Inhibition rate of SMMC-7721 cells was determined by using MTT method.Apoptosis rate and cell cycle distribution were measured by flow cytometry.Immunocytochemistry staining was used to observe th...     

Bcl -2 基因沉默对胃腺癌SGC-7901 细胞5-Fu 敏感性的影响

目的 探讨B 淋巴细胞瘤-2（Bcl -2）基因沉默增强胃腺癌SGC-7901 细胞对5- 氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的价值。方法 设立人胃腺癌SGC-7901 细胞研究组和对照组,采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测两组人胃腺癌SGC-7901 细胞中Bcl-2 mRNA 的表达。研究组采用脂质体法转染化学合成的Bcl-2 siRNA 序列至人胃腺癌SGC-7901 细胞,对照组不进行干预。比较转染前后两组Bcl-2 mRNA 的表达水平。两组均添加不同浓度5-FU,采用Annexin V 标记和流式细胞仪检测48 h 后两组不同浓度5-FU 细胞株的增殖抑制率和凋亡率。结果 两组转染前Bcl-2 mRNA 相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。与转染前比较,研究组转染后的Bcl-2 mRNA 相对表达量降低（P <0.05）;与对照组比较,研究组转染后的Bcl-2mRNA 相对表达量降低（P <0.05）。与对照组比较,研究组培养48 h 的细胞增殖抑制率和凋亡率较高（P <0.05）。结论 Bcl -2 基因沉默可增强胃腺癌SGC-7901 细胞对5-FU 的敏感性,抑制癌细胞的增殖,并促进癌细胞的凋亡。Bcl -2 基因沉默可能是改善胃腺癌5-FU 疗效的有效方法。     

siRNA抑制syk基因对外周T细胞淋巴瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨siRNA抑制脾酪氨酸激酶(syk)基因后对外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78细胞增殖与凋亡的影响.方法 针对syk基因特异靶点设计3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3),采用电穿孔法转染外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78,同时设Mock组和siRNA-NC组,转染48 h后,分别用RT-PCR和Western blot技术检测syk mRNA和蛋白的表达水平,筛选出最有效的syk siRNA;syk siRNA转染HUT-78后分别用软琼脂克隆形成实验检测syk下调后HUT-78细胞的克隆形成能力,MTT法检测干扰24、48、72 h后细胞增殖情况,流式细胞术检测syk下调后HUT-78细胞的凋亡情况.结果 RT-PCR和Western blot结果显示,与Mock组和siRNA-NC组相比,3条siRNA均能有效降低HUT-78细胞中syk mRNA和蛋白的表达,其中syk siRNA-1抑制效果最明显.克隆形成实验显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的克隆形成能力与Mock组相比明显下降(P<0.05);MTT实验结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的增殖能力与Mock组相比显著下降(P<0.05);流式细胞术结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的凋亡比例明显高于Mock组(P<0.05).结论 siRNA下调syk基因表达后可抑制外周T细胞淋巴瘤细胞的增殖、克隆形成,促进凋亡,推测syk基因在外周T细胞淋巴瘤的发生发展中发挥重要作用,有可能成为外周T细胞淋巴瘤基因治疗的新靶点.     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。     

携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的 构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究.方法 将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70.结果 成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109.HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论 构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础.