大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的：构建大鼠葡萄糖转运体1（GLUT1）的真核表达载体。 方法： 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1，随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果： 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论： 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.     

人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.     

grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的 构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系.方法 用RT-PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/grp78并测序鉴定.用构建成功的pcDNA3.1(+)/grp...     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

syk真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响

目的:构建非受体蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞,使其在细胞中稳定表达,以研究Syk对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响.方法:以RTPCR法从人乳腺癌细胞株MDA-MB-468扩增出syk编码序列基因片段,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中.对重组质粒进行酶切、PCR及测序鉴定后,以脂质体介导法转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,经G418筛选,构建syk基因稳定表达的细胞株,通过Western blot、RT-PCR和流式细胞术检测转染乳腺癌细胞Syk、MHC-Ⅰ及ICAM-Ⅰ的表达.结果:构建了hsyk真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/hsyk,并在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中获得稳定表达.表达Syk的MDA-MB-231细胞同时可以高表达MHC-Ⅰ和ICAM-Ⅰ.结论:成功地构建了syk真核表达载体并在真核细胞中表达,为进一步的肿瘤免疫研究奠定了实验基础.     

人IL-6受体胞外区真核表达载体的构建及体外表达

目的 构建人IL-6受体(IL-6R)胞外区真核表达载体,检测其在体外培养细胞中的表达.方法 利用PCR扩增IL-6R胞外区,克隆到pcDNA3.1(+)中,用双酶切、测序鉴定.重组质粒通过脂质体转染HL-60细胞,用G418进行筛选,利用Western印迹检测IL-6R蛋白表达.结果 PCR扩增出1 218 bp的目的 片段,双酶切和测序结果显示重组质粒正确.Western印迹结果显示转染细胞能够表达目的 蛋白.结论 成功构建了人IL-6R胞外区真核表达载体,并且能够在真核细胞中表达.     

IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。     

pcDNA3.1(+)-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1(+)-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1(+)-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

PBAD表达系统对抗-HBs Fab抗体表达的影响

目的研究PBADP替换Plac的原核表达系统对重组抗-HBs Fabs的表达效率、产量及其抗体活性的影响。方法通过Western blot、抗体不同稀释度的Dot blot和抗原特异性结合实验，对两种表达系统进行比较。结果在PBAD控制下表达的抗．HBs Fabs与Plac控制下的相比，Western blot显示两种表达系统都能完整表达抗-HBs Fab抗体，Mr为50000。PBAD表达系统表达的抗-HBs Fabs多以可溶形式存在于周质腔中，而Plac表达系统表达的抗-HBs Fabs更多的释放入培养上清液。抗体不同稀释度的Dot blot结果显示pBAD-抗HBs Fab表达系统表达的抗体效价较pComb3-抗HBs Fad高，乙型肝炎表面抗原特异性结合实验证实两种表达系统表达的抗体的抗原结合活性无明显差别。结论PBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量并保持了原抗体活性。     

一种高效表达小干扰RNA载体的构建研究

目的：用mir30前体骨架来构建高效表达小干扰RNA载体。方法：通过基因合成的方法，将mir30前体骨架进行全长基因合成，并在合成的mir30前体骨架中引入合适的酶切位点用于外源发夹DNA的克隆，然后将之克隆到含U6启动子的表达载体中。将针对绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小干扰RNA克隆到以上表达载体中，通过转染及Western blot来检测新的小干扰RNA表达载体的基因沉默效率。结果：同目前常用的含polⅢ的小干扰RNA表达载体相比较，用mir30前体骨架表达针对GFP的小干扰RNA的表达载体可以明显抑制GFP的表达。结论：用mir30前体骨架构建的小干扰RNA表达载体可高效表达外源小干扰RNA。     

β雌激素受体沉寂表达载体的构建及表达

目的构建雌激素受体β(ERβ)亚型沉寂表达载体,并观察其转染成骨细胞后抑制ERβ基因表达的效果。方法参考人ERβ基因mRNA序列,设计、合成ERβ-shRNA的DNA Oligo后行PCR扩增,获得的shRNA双链DNA片段与pLVTHM-GFP质粒双酶切后连接,转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞。取鉴定正确的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA重组质粒转染人成骨hMG63细胞,实验分空白载体组、空白对照组和ERβ-siRNA组,转染48h后于倒置荧光显微镜下观察各组细胞的转染效果,并采用流式细胞术检测转染效率。抽提各组细胞的总RNA,经RT-PCR生成cDNA,Realtime-PCR检测ERβ基因的抑制效率。结果倒置荧光显微镜下观察显示,ERβ-siRNA组hMG63细胞90%以上呈现绿色荧光。流式细胞术检测ERβ-shRNA转染hMG63细胞的转染效率为92.3%。Realtime-PCR检测结果表明,ERβ-siRNA组ERβ表达量(0.17±0.01)仅约为空白载体组(1.00±0.01)的17.3%(P0.001),ERβ-siRNA对hMG63细胞ERβ基因的抑制效率约为83%。结论成功建立了人ERβ沉寂表达的成骨细胞模型,慢病毒载体介导的ERβ-siRNA能有效抑制成骨细胞ERβ基因的表达,满足了研究成骨细胞中ERβ相关功能的需要。     

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

SOD1真核表达载体的构建及表达

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染HeLa细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用RT-PCR、Western blot检测SOD1的表达。结果:成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒,转染HeLa细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;RT-PCR及Western blot检测结果表明,所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。结论:成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1,为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。     

人重组pEGFPC1-uPA ATF质粒的构建及表达的研究

目的构建含人uPA ATF基因的真核表达质粒，并研究其对小鼠细胞株Pam212细胞的影响。方法设计引物，利用PCR从原核表达质粒中扩增人uPAA1F基因片断，并导入真核表达载体的绿色荧光蛋白pEGFPCI中，利用电泳和测序检测构建状况，荧光显微镜观察和免疫细胞化学检测转染情况，通过MTT、体外迁移实验检测对小鼠Pam212细胞株的影响。结果电泳和测序表明构建的质粒准确，uPA ATF cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；质粒转染Pam 212细胞株成功，并且能抑制细胞的增殖和迁移。结论成功构建了真核表达载体pEGFPC1-uPA ATF质粒，明确了人uPA ATF基因片断能降低小鼠细胞的增殖和迁移，为进一步在体实验研究打下了基础。