人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基     

KGF基因在COS7细胞中的表达及其活性检测

目的：利用COS7细胞表达角质细胞生长因子(KGF)并检测其活性。方法：利用脂质体把KGF基因转入COS7细胞中，再用Western印迹和ELISA方法检测KGF蛋白的表达，然后用MTT法检测其活性。结果：KGF基因在COS7中得到了表达，并对小鼠肠上皮细胞(IEC-6)具有刺激增殖作用。结论：KGF有望成为肠型放射病治疗的新型药物。     

蚓激酶基因在真核细胞COS-7中的表达

目的：为了实现蚓激酶基因片段F-3，F-5在真核细胞COS-7中的表达，获得具有生物学活性的重组蚓激酶蛋白。方法：将F-3，F-5与分泌表达载体pcDNA3，1( )连接，构建重组表达质粒pcDNA-3和pcDNA-5，利用COS-7细胞进行基因F-3和F-5的瞬时表达；纤维蛋白平板法对培养液上清进行活性检测。结果：蚓激酶基因片段F-3，F-5在真核细胞COS-7中实现了表达；SDS-PAGE显示蛋白质条带，纤维蛋白平板法检测培养液上清有明显的纤溶活性。结论：蚓激酶基因片段F-3，F-5可在真核细胞COS-7中分泌表达，表达产物具有一定的纤溶活性。     

rhTPO克隆及其在COS—7细胞中的瞬时表达

血小板生长因子（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）是一种正常生理状态下的造血生长因子，它刺激造血祖细胞向巨核细胞的分化及血小板的生成和释放。该实验从６月龄人胚肝脏中分离ＲＮＡ，经逆转录ＰＣＲ等步骤克隆出了ＴＰＯｃＤＮＡ，并进行了序列分析。将ＴＰＯｃＤＮＡ亚克隆至哺乳动物细胞瞬时表达载体ｐＣＭＶ４，形成了重组表达质粒ｐＣＭＶ４／ＴＰＯ。以该重组质粒转染ＣＯＳ７细胞，可测到ＴＰＯ在ＣＯＳ７细胞中的瞬时表达     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

人转化生长因子β1在COS-7细胞中的表达

转化生长因子β1(TGFβ1)是一种多功能的细胞生长因子,它几乎参与了体内所有的病理和生理过程,同时还在创伤愈合、肿瘤抑制、免疫调节、神经营养等多方面具有广泛的应用前景。TGFβ1的研究具有十分重要的理论和应用意义。我们在完成了对TGFβ1cDNA的克隆和鉴定之后,对其在哺乳动物细胞COS-7中的表达做了进一步的研究。     

用脂质体法转染COS—7细胞条件的优化

现有的多种真核细胞基因转染方法存在繁琐和效率低的问题，我们利用脂质体包裹的方法，以瞬时表达系统中最常用的ＣＯＳ－７细胞为靶，观察了影响转梁效率的多种因素，优化了转染条件。     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

靶向PD-1/PD-L1放射性核素分子探针及其在恶性肿瘤中的应用

程序性细胞死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）免疫治疗已成为一种治疗多种恶性肿瘤的重要方法,但仅有部分患者临床获益,其影响因素之一是恶性肿瘤PD-1/PD-L1的表达水平。使用放射性核素标记完整单克隆抗体和抗体片段等制成靶向PD-1/PD-L1放射性核素分子探针进行显像,可无创、实时、动态地监测肿瘤PD-1/PD-L1的表达并量化其表达水平,进而筛选适宜治疗的患者、全面评估治疗疗效和预后。笔者综述了靶向PD-1/PD-L1放射性核素分子探针及其在恶性肿瘤中的应用。     

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的 从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1（KGF-1）编码区序列,构建真核荧光表达载体.方法 从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录 PCR获取KGF-1 cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定.将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞（marrow stroma cells,MSCs）48 h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致.KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内.结论 成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础.     

microRNA-7真核表达载体的构建及其对细胞增殖能力的影响

目的构建miR-7真核表达载体,以研究miR-7过表达后对细胞增殖能力的影响。方法以人全血标本基因组为模板,PCR扩增miR-7序列,然后将该序列克隆入pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体。将构建好的载体瞬时转染入293FT细胞中,利用RT-PCR技术对转染前后293FT细胞中miR-7的表达水平进行检测。将pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体瞬时转染入乳腺癌细胞系MCF-7中,利用CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后细胞增殖能力的变化。结果构建的pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定结果正确,实时定量RT-PCR结果表明,与转染pHRS-1cla-CMV-EGFP对照载体细胞相比,转染pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体72 h后的293FT细胞成功地过表达miR-7达76.8倍。CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力显著性下降（P〈0.05）。结论成功构建了pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体,瞬时转染后细胞可以有效地高表达miR-7,同时证明过表达miR-7可以使细胞的增殖能力受到明显抑制。     

MXR7基因在人肝癌组织中的表达及其临床意义

 目的 检测MXR7基因在人肝细胞癌组织中的表达.方法 应用32P标记的MXR7cDNA作为探针,通过Northern blot分析对正常人12种不同组织和病理证实的术前未做治疗的7例非肝肿瘤组织及30例肝癌和癌旁肝组织、12例正常肝组织中MXR7基因的表达进行检测.结果 MXR7mRNA在人肝脏等12种正常组织及7例其它部位肿瘤组织中均不表达;在人肝癌中呈高表达,而癌旁肝组织中呈低表达,其阳性表达率分别为76.7%和13.3%.在血清AFP阴性的肝癌患者和肿瘤直径<5 cm的肝癌中,MXRTmRNA阳性表达率分别为90%和83.3%.肝癌患者手术后1 a和2 a生存率分别是59.1%和54.5%.结论 MXR7基因在人肝癌组织中的高水平表达具有普遍性、特异性和早期性,提示MXR7基因可以作为肝癌的生物学标志物,对肝穿刺组织进行MXR7基因表达检测有助于发现AFP阴性的早期肝癌.未发现MXR7mRNA阳性表达与肝癌患者的预后有明确关系.     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

Prior irradiation results in elevated programmed cell death protein 1 (PD-1) in T cells

Purpose: In this study we addressed the question whether radiation-induced adverse effects on T cell activation are associated with alterations of T cell checkpoint receptors.

Materials and methods: Expression levels of checkpoint receptors on T cell subpopulations were analyzed at multiple post-radiation time points ranging from one to four weeks in mice receiving a single fraction of 1 or 4?Gy of γ-ray. T cell activation associated metabolic changes were assessed.

Results: Our results showed that prior irradiation resulted in significant elevated expression of programmed cell death protein 1 (PD-1) in both CD4+?and CD8+?populations, at all three post-radiation time points. T cells with elevated PD-1 mostly were either central memory or naïve cells. In addition, the feedback induction of PD-1 expression in activated T cells declined after radiation.

Conclusion: Taken together, the elevated PD-1 level observed at weeks after radiation exposure is connected to T cell dysfunction. Recent preclinical and clinical studies have showed that a combination of radiotherapy and T cell checkpoint blockade immunotherapy including targeting the programmed death-ligand 1 (PD-L1)/PD-1 axis may potentiate the antitumor response. Understanding the dynamic changes in PD-1 levels in T cells after radiation should help in the development of a more effective therapeutic strategy.     

一种新的血管生成抑制因子-TSF的设计及表达

目的 选择PF4和TSP1的高活性片段设计融合基因－TSF，在大肠肝菌表达，细胞水平上检测表达产物的生物学活性。方法 PF4的C－末端13肽和TSP1的429－459片断31肽通过Gly-Pro-Gly肽桥设计为融合蛋白－TSF。采用pGEX-2T载体在E.coli JM109中表达TSF蛋白。采用MTT方法测定TSF及其相关性GST－TSF，PF4（58－70），TSP1（429－459）等对血管内皮细胞，平滑肌细胞，QGY7721人肝癌细胞，HLF人肺成纤维细胞等生长的抑制效应。结果 合成的TSF融合基因，克隆到pGEX-2T载体，转化E .coli JM109，获得了TSF蛋白的高效表达。建立了TSF蛋白的纯化复性方法，获得了GST－TSF融合蛋白及TSF蛋白。TSF，GST－TSF，PF4（58－70）和TSP1（429－59）均特异抑制血管内皮细胞的生长，其中TSF的活性最强，活性大小次序为TSF＞GST－TSF＞PF4（58－70）＞TSP1（429－459）。结论 融合表达蛋白－TSF在细胞水平上能高效特异抑制血管内皮细胞的生长。