16S rRNA基因PCR对细菌感染的分子生物学研究

细菌核糖体小亚基ＲＮＡ（１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａ ＲＮＡ，１６Ｓ ｒＲＮＡ）为所有的细菌共有，其编码的基因具有高度的保守性，通过１６Ｓ ｒＲＮＡ基因保守区引物进行ＰＣＲ扩增，可早期、快速判断细菌的存在与否，并通过序列分析，进一步鉴定菌种和进行种系发生学分析。本文就细菌１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的特点、ＰＣＲ扩增后对细菌感染的判断、菌株耐药性和流行病学研究等方面作一概述。     

肾综合征出血热病毒分型的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对４株肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒进行了分型。ＨＦＲＳ病毒的ＲＮＡ经逆转录为ＣＤＮＡ后用ＮＴＮ（野鼠型）、ＳＥＯ（家鼠型）两种引物进行体外扩增，经琼脂糖凝胶电泳，ＰＣＲ产物的ＮＤＡ片段与Ｍａｒｋ对照，证实扩增出的产物为ＨＦＲＳ病毒ＤＮＡ片段。ＰＣＲ分型与物异性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）间接免疫荧光法分型作比较，结果相符合。     

庚型肝炎病毒母婴传播的研究

用ＥＬＩＳＡ法对１１０名健康孕产妇进行血清抗－ＨＧＶ测定,阳性和可颖阳性者再用ＲＴ－ＰＣＲ检测血清ＨＧＶ ＲＮＡ,并对ＨＧＶ ＲＮＡ阳性孕产妇的新生儿脐血和婴儿血进行ＨＧＶ ＲＮＡ检测。结果 １１０名孕产中有７人（６．３６％）抗－ＨＧＶ阳性８人可疑阳性。其中４人被检测到ＨＧＶ ＲＮＡ,阳性率２６．６６％（４／１５）。她们所产的４名婴儿中２人血清ＨＧＶ ＲＮＡ阳性。提示ＨＧＶ的母婴传播率为５０％（２     

肾综合征出血热患者病原基因的检测分析

目的：探讨肾综合征出血热基因诊断的方法。方法：采用肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）Ⅰ型病毒ＨＴＮ株,Ⅱ型病毒Ｒ２２株的Ｍ基因序列为参照,设计出引物Ａ１￣Ａ７,用ＲＴ－ＰＣＲ技术,直接从ＨＦＲＳ患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中检测ＨＦＲＳ－ＲＮＡ。（２）２０例病人中Ⅰ型引物扩增阳性者５例,Ⅱ型引物阳性者１９例,二者重叠阳性者４例。结论：以ＨＦＲＳ病毒Ｍ片段Ｇ１区核苷酸序列设计的引物可以用于ＨＦＲＳ临床病     

恙螨体内肾综合征出血热病毒基因的套式PCR检测

目的：检测恙螨体内微量肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）基因。方法：选择ＨＦＲＳＶ膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成两对引物，采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ，建立了反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法，扩增产物经凝胶电泳及点印迹杂交证实具有特异性。结果：ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离恙螨５０只组，经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性；ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组，ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只、１０只和５只组，游离螨１０只和５只组均未见明显扩增带。进一步用ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ检测，在ＲＴ－ＰＣＲ未检测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，最低检出为５只螨组。并用核酸分子杂交技术进一步证实了上述结果。结论：ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点，可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ，从分子生物学角度为恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了直接证据。     

多聚酶链反应检测骨组织中结核分枝杆菌的临床研究

关于骨关节结核的ＰＣＲ诊断报道甚少。本文介绍用ＰＣＲ技术检测手术取检骨组织４５例，并与病理学诊断和临床诊断进行比较。结核分枝杆菌阳性２１例，阳性率为４６．６％，病理学诊断１０天例骨关节结核，阳性率为２２．２％，临床诊断２０例，ＰＣＲ阳性１６例与临床诊断的符合率为８０．０％。结果提示，ＰＣＲ技术用于骨组织结核分枝杆菌的诊断与临床诊断有较好的符合率，对于骨关节结核早期诊断、鉴别诊断具有特异性敏感性高的     

加热与洗涤法对HBV,HCV血清标志的影响

采用ＥＬＩＳＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ），对经６０℃１０ｈ加热的ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢＣ及抗－ＨＣＶ阳性血清和洗涤４次的ＲＢＣ洗涤及放散液的血清标志及ＨＢＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ进行了检测。结果，６０℃加热１０ｈ用ＥＬＩＳＡ检测血清标志均由强阳性转为阳性，ＰＣＲ检测ＨＢＶＤＮＡ及ＨＣＶＲＮＡ均为阴性；洗涤液用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ检测血清标志及ＨＢＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ均呈阴性反应，放散液用ＥＬＩＳＡ检测阴性，用ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ１０份标本９份阴性，１份阳性。提示６０℃加热１０ｈ和洗涤ＲＢＣ可灭活或去除血清中大部分ＨＢＶ、ＨＣＶ及其血清标志。     

16SrRNA在多聚酶链反应麻风诊断中的特异性研究

目的：了解用16SrRNA作引物，多聚酶链反应（PCR）技术检测麻风病的特异性。方法：用16SrRNA分子片段作引物，用多聚酶链反应检测20余株非麻风分枝杆菌，麻风分枝杆菌标准菌株及4例传统方法确诊的麻风病患者。结果：麻风标准菌株和4例中的3例患者检测为阳性，其余20余株非麻风分枝杆菌均阴性。结论：16SrRNA作引物，PCR方法检测麻风病确有其特异性。     

聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒的初步研究

应用美国Ａｂｂｏｔｔ公司Ｓｉｍｏｎｓ等人报道的引物序列，以逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）检测３８例甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）指标均阴性的慢性肝炎患者血中的庚型肝炎病毒核酸（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ）。２０例健康供血员血清作为对照，同时用ＲＴ－ＰＣＲ法测丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶＲＮＡ），结果３８例慢性肝炎患者中４例ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ阳性，其中２例同时有ＨＣＶＲＮＡ阳性。表明本地区有ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染存在。     

恙螨体内汉滩病毒检测及定位的研究

采用分子生物学方法对小盾纤恙螨的媒介意义进行研究。结果表明：用ＲＴＰＣＲ和ＮｅｓｔｅｄＲＴＰＣＲ从恙螨体内检测到汉滩病毒ＲＮＡ;用原位分子杂交技术在恙螨的卵巢细胞、支肠细胞等组织中检测到汉滩病毒ＲＮＡ。以上结果为恙螨的媒介意义提供了具有分子水平的直接证据,对ＨＦＲＳ的流行病学和预防具有重要的理论意义和实用价值。     

一种伤寒沙门氏菌分型的新方法

目的 探讨伤寒沙门氏菌分型的新方法。方法 利用PCR扩增标记的Dig-dUTP-16SrRNA基因探针,分析40株伤寒沙门氏菌染色体经Pst Ⅰ消化后的16SrRNA基因限制性图谱。结果 40株伤寒沙门氏菌的分属14个不同的RT,各菌株杂交片段范围为4．4kb-29.7kb,每个RT内有杂交带5－10条不等,绝大多数为5－6条。结论 伤寒长期在某些地区流行可能与一些核糖核酸型仅出现这些地区,存在相对的地区性有关;同一个暴发点菌株具有相同的RT。16SrRNA基因限制性图谱分析可作为追踪传染源和探明传播途径的方法。     

产ESBL肺炎克雷伯菌16SrRNA甲基化酶分布与耐药性研究

目的探讨产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株16SrRNA甲基化酶基因分布以及与耐药谱的关系。方法采用PCR法检测苍南县人民医院临床分离出的69株非重复产ESBL肺炎克雷伯菌中的16SrRNA甲基化酶基因（rmtB和annA）,通过DNA测序,确定ESBL基因及整合子基因;质粒接合试验和质粒消除试验确定16SrRNA甲基化酶基因传播途径,ERIC-PCR技术进行基因分型。结果69株产ESBL肺炎克雷伯菌rmtB阳性菌20株（28．99％）,其中2株同时携带有rmtB和amA。20株检测mtB阳性株均携带有CTX-M基因,14株为CTX-M-14基因,6株为CTX-M-15基因;14株携带TEM-l基因;8株携带SHV基因中,5株SHV-12基因,3株SHV-11基因;3株携带OXA-10基因;3株携带VBE-1基因。另有12株携带有intl阳性,含有5种不同耐药基因盒,分别携带drfA25、drfAl、drfAl2、aadAl、aadA2、sat和blavEB-基因。ERIC-PCR法显示20株16SrRNA甲基化酶基因阳性的肺炎克雷伯菌主要分为5型,A型为优势克隆菌株。质粒接合和消除试验发现A型克隆株KP5和KPl6rmtB均位于一质粒上并通过接合传播。结论产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株中普遍存在16SrRNA甲基化酶基因mtB,导致对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药。rmtB通过水平基因传播和克隆传播两种方式进行播散,并且存在同时产ESBLs、16SrRNA甲基化酶和I类整合子肺炎克雷伯菌传播。     

细菌性感染PCR诊断方法的建立及其应用研究

目的通过通用引物PCR,为建立一种实用、快速可靠细菌感染PCR检测方法奠定基础。方法收集100例疑似血流感染患者的血液进行细菌培养,同时检测细菌16S rRNA基因,测定和分析所得DNA序列,对培养结果与PCR结果进行比较;采用倍比稀释法进行PCR灵敏度检测。结果 100份血液标本中细菌培养8份阳性,阳性率为8.0%;PCR法19份阳性,阳性率为19.0%,细菌培养与PCR检测结果比较,差异有统计学意义(χ2=9.09,P<0.05);测序结果显示DNA序列与GenBank公布的基因序列同源性很高,PCR可检测范围至1.5×102CFU/ml。结论只要严格控制污染,通过16S rRNA基因PCR技术对疑似血流感染的临床诊断具有重要意义。     

16SrRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌中流行情况调查

目的了解台州地区肺炎克雷伯菌临床分离株中16SrRNA甲基化酶流行情况,为临床感染的预防和治疗提供参考资料。方法收集台州地区2010年1月~2012年12月住院患者标本中分离的肺炎克雷伯菌共计859株,所有菌株均为非重复株。采用PCR及测序方法检测16SrRNA甲基化酶基因。结果 2010-2012年肺炎克雷伯菌对耐氨基糖苷类药物的耐药率逐年升高,经PCR扩增和DNA测序检出16SrRNA甲基化酶基因阳性株分别为2010年（14株,阳性率5.51%）、2011年（18株,阳性率6.22%）、2012年（21株,阳性率6.65%）,检测出的基因型为armA、rmtB两种类型且以rmtB为主,rmtA、rmtC、rmtD、npmA型均阴性。所有16SrRNA甲基化酶基因阳性肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物高度耐药（MIC≥256mg/L）。结论肺炎克雷伯菌耐氨基糖苷类耐药率不断增加,16SrRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌中所占比重呈逐年升高的趋势,且16SrRNA甲基化酶基因阳性菌株对氨基糖苷类抗生素高度耐药。检测到16SrRNA甲基化酶基因型rmtB和armA,以rmtB为主。     

16SrRNA基因在新生儿败血症诊断中的应用

目的:应用聚合酶链反应(PCR)检测细菌16SrRNA基因,研究其在新生儿败血症中的应用。方法:抽取临床疑为细菌感染的265例新生儿的静脉血,分别做血培养和细菌16SrRNA的基因检测。于血标本中抽提DNA后用聚合酶链反应(PCR)扩增,将扩增产物电泳后经凝胶成像系统扫描。结果:PCR检测阳性率为6.4%(17/265),明显高于血培养的阳性率〔3.4%(9/265)〕,差异有统计学意义(P0.05)。结论:与血培养相比,检测细菌16SrRNA基因对新生儿败血症诊断的特异性和敏感度更高。     

PCR检测细菌DNA对大鼠结肠吻合口漏的早期诊断

目的探讨PCR检测大鼠血液中细菌DNA对结肠吻合口漏的早期诊断价值。方法健康Wistar雌性大鼠48只，随机分成：A组（n=8）为假手术组；B组（n=20）为结肠-结肠吻合组；C组（n=20）为结肠吻合口漏组；采集手术前后外周血，抽提DNA，比较PCR检测大肠杆菌lacZ基因和细菌共有的16SrRNA基因的PCR阳性率，并观察各组的病理学情况。结果C组外周血lacZ基因的PCR阳性率显著高于B组（P〈0．05）；C组外周血16SrRNA基因的PCR阳性率与B组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PCR检测术后外周血lacZ基因对结肠吻合口漏的诊断可能有一定的意义，而检测术后外周血16SrRNA基因对结肠吻合口漏的意义可能不大。     

PCR技术快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立空肠弯曲菌的快速检测方法。方法用PCR法扩增标本菌株中弯曲菌属16SrRNA片段、空肠弯曲菌M apA片段和结肠弯曲菌CeuE片段,通过电泳后对产物进行分析。结果11份标本中有7份检出弯曲菌属16SrRNA片段,其中3份样品中检测到空肠弯曲菌M apA片段,4份样品中检测到结肠弯曲菌CeuE片段。结论PCR技术可用于空肠弯曲菌的快速检测。     

PCR法快速检测阳性血培养瓶中葡萄球菌属

目的 建立采用聚合酶链反应(PCR)技术从阳性血培养瓶中检测葡萄球菌属的方法.方法 以493例阳性血培养瓶中的细菌为检测对象,采用盐酸胍-苯甲醇法提取细菌DNA,然后以PCR扩增16S rRNA、ssa和mecA基因鉴定葡萄球菌属及其对甲氧西林的耐药性,并将检测结果与传统方法相比较.结果 PCR法检测阳性血培养瓶中葡萄球菌属的时间约为4 h,其较传统方法的24～48 h明显缩短;以传统方法为金标准,其检测葡萄球菌属的灵敏度和特异度达98.6%和100.0%,此外PCR法检测耐甲氧西林葡萄球菌较传统方法也具有明显优势.结论 该方法灵敏度高,特异性强,检测方便快速,适合从阳性血培养瓶中检测葡萄球菌属.     

香港海鸥形菌分型方法建立与病原学分布调查

目的通过对深圳市感染性腹泻患者标本与外环境水产品标本的检测,掌握深圳市香港海鸥形菌病原学特征及分子分型。方法用传统方法和荧光PCR法同时检测香港海鸥形菌,阳性菌株用K-B法做药敏试验和PFGE分子分型。结果在329份淡水鱼中共检出7份阳性标本,579份腹泻病人标本未检出。该菌对临床常用的24种抗生素耐药性检测结果显示,对氨苄西林、头孢他啶、头孢噻吩、头孢噻腭、头孢哌酮、头孢曲松耐药,头孢西丁为中介,其余均为敏感。7株香港海鸥形菌生化反应阳性的,荧光PCR结果均为阳性。PFGE分子分型表明7株菌不具有同源性。结论本文建立一套完整的对该菌的分离鉴定、基因诊断和PFGE分子分型方法;了解深圳地区主要流行菌型,预测深圳地区该菌的流行趋势,为应对食源性疾病突发事件和水产品安全问题做好技术储备。