人羊膜间充质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的疗效评价

目的观察不同途径移植人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型大鼠的生物学效应及其在体内的分化。方法采用胰蛋白酶-胶原酶消化法分离hAMSCs,流式细胞术分析表型。40只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、hAMSCs静脉移植组和原位移植组。采用单侧前脑内侧束(MFB)注射6-羟基多巴胺建立PD大鼠模型。通过舌下静脉或于MFB原位移植3×105个hAMSCs。腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转观察大鼠的行为变化,免疫荧光染色法检测人细胞核抗原及神经元微管结合蛋白(microtubule-associated protein 2,MAP-2)的表达,免疫组化染色法检测酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达。结果与模型组比较,hAMSCs静脉移植组和原位移植组大鼠旋转次数均明显减少(均P<0.05),前者行为学改善可持续至移植后6 w,后者则至8 w;免疫荧光染色显示,hAMSCs在原位移植区可存活至少12 w,并表达MAP-2;免疫组化染色显示静脉和原位移植hAMSCs均可上调PD模型大鼠黑质TH表达,但后者强于前者。结论 hAMSCs能改善PD模型大鼠的运动行为,原位移植优于静脉移植,其机制可能与上调黑质TH表达有关。hAMSCs可在原位移植部位分化为多巴胺能神经元样细胞。     

人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗转基因APP+小鼠的机制***◆

背景：研究发现APP基因与阿尔茨海默病发病密切相关。课题组前期实验发现人羊膜间充质干细胞静脉移植可以促进阿尔茨海默病APP+转基因小鼠的学习,记忆能力改善。 目的：探讨人羊膜间充质干细胞尾静脉移植后,能否归巢到小鼠脑组织中,并分化为相关的中枢神经细胞,治疗阿尔茨海默病。 方法：无菌条件下体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代将细胞浓度调整为1×109 L-1,经尾静脉注入0.5 mL至细胞移植组转APP+基因小鼠体内;对照组经尾静脉注入同体积的生理盐水;正常组转APP-基因小鼠不给予任何干预措施。采用免疫组化方法检测、测定Brdu标记的人第3代羊膜间充质干细胞在小鼠脑组织中的表达,各组小鼠脑组织中GFAP、Nestin和NSE的表达。 结果与结论：光镜下观察可见,移植组小鼠脑组织中大部分细胞核被染成蓝色,但有一些细胞核被染成棕色或褐色,Brdu呈阳性。与对照组相比,移植组小鼠脑组织中的GFAP增加了近4倍,表达显著增加,甚至超过正常组的表达(P < 0.05);Nestin的表达则显著升高,增加了近10%,但是还比正常组低了近20%(P < 0.05)。NSE的表达降低了近1/3,但仍高于正常组(P < 0.05)。表明人羊膜间充质干细胞尾静脉移植治疗阿尔茨海默病可能是通过羊膜间充质干细胞归巢到转基因APP+小鼠脑组织中,并分化成中枢神经细胞的途径实现的。 关键词：人羊膜间充质干细胞;转基因APP+小鼠;尾静脉移植;胶质纤维蛋白;巢蛋白;神经元特异性烯醇化酶     

人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP+转基因鼠的

目的：评估人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP转基因鼠的有效性和安全性。 方法：饲养转基因APP+胎鼠,定期合笼,利用PCR技术快速鉴定转基因鼠,以刚果红染色法观察脑组织切片中的β-淀粉样蛋白沉积。严格无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜,体外分离培养羊膜间充质干细胞,至第3代经尾静脉移植。Morris水迷宫测试移植前后小鼠学习、记忆能力。移植当天开始称重,每隔三天一次,持续三周。移植后解剖小鼠,收集全血并分离血清,进行心、肝、肾功能的血液生化和12项肿瘤标记物检测,对该细胞治疗的安全性作综合评价。 结果：移植后小鼠学习、记忆能力明显增强。移植组动物的体重增长趋势与对照组相比无明显差异（P＞0.05）,未见肿瘤和死亡发生。血液生化和12项肿瘤标记物各指标无明显差异（P＞0.05）。 结论：人羊膜间充质干细胞尾静脉移植治疗阿尔茨海默氏症小鼠明显促进小鼠学习、记忆能力,未见致死致瘤现象发生,心、肝、肾功能未受影响。利用该种干细胞移植治疗阿尔茨海默氏病是安全可行的。     

人羊膜间充质干细胞移植对阿尔茨海默病转基因小鼠的行为学和β-淀粉样蛋白的影响

背景：研究发现APP基因与阿尔茨海默病发病密切相关。β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病患者脑内老年斑的主要成分，基因突变和外界环境的影响能破坏β-淀粉样蛋白的动态平衡，从而引发或加速阿尔茨海默病的产生和发展。 目的：探讨人羊膜间充质干细胞尾静脉移植对阿尔茨海默病转基因小鼠学习记忆能力及脑组织β-淀粉样蛋白表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-05/10在郑州大学微生物学与免疫学教研室和河南省中医药治疗研究院完成。 材料：健康剖宫产产妇志愿捐献的羊膜，由郑州大学第一附属医院产科提供。APP转基因鼠29只，PCR技术鉴定转APP-基因小鼠9只，作为正常组；转APP+基因小鼠20只，随机分为细胞移植组、对照组，10只/组。 方法：无菌条件下体外分离培养人羊膜间充质干细胞，传至第3代将细胞浓度调整为1×109 L-1，经尾静脉注入0.5 mL至细胞移植组小鼠体内；对照组经尾静脉注入同体积的生理盐水；正常组小鼠不给予任何干预措施。 主要观察指标：采用Morris水迷宫测定小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及在平台象限的时间，刚果红染色观察小鼠脑组织内β-淀粉蛋白的表达。 结果：定位航行试验中，移植前与正常组比较，细胞移植组、对照组小鼠逃避潜伏期差异均有显著性意义（P < 0.05）；移植后2周细胞移植组小鼠逃避潜伏期与正常组基本相似（P > 0.05），但明显短于对照组（P < 0.05）。空间探索试验中，移植前后小鼠穿越平台次数及其在平台象限的时间3组间比较差异均无显著性意义（P > 0.05）。移植后1个月，正常组未见或仅见极少量的β-淀粉样蛋白沉积，细胞移植组淀粉样蛋白的沉积明显少于对照组。 结论：人羊膜间充质干细胞尾静脉移植能促进阿尔茨海默病转基因小鼠空间定位及学习记忆能力的提高，且减少小鼠脑内β-淀粉样蛋白的沉积。     

骨髓基质细胞及血管内皮祖细胞共移植对局灶性脑缺血大鼠系列生长因子表达的影响

目的 观察经静脉移植骨髓基质细胞(BMSCs)及血管内皮祖细胞(EPCs)后血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、脑源性生长因子(BDNF)、胶质源性生长因子(GDNF)和神经生长因子(NGF)这9种细胞因子的表达. 方法 80只健康成年Wistar 大鼠按照随机数字表法分为模型对照组、BMSCs移植组、EPCs移植组及联合移植组,每组20只.线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型.造模24h后,分别取浓度为3x106个/mL的BMSCs、EPCs悬液及两者混合液1mL经鼠尾静脉移植入BMSCs移植组、EPCs移植组及联合移植组;模型对照组鼠尾静脉注射1 mL生理盐水.移植后7d,实时荧光PCR、Western boltting检测各组大鼠脑内生长因子的表达. 结果 联合移植组中bFGF、VEGF、BDNF mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).BMSCs移植组中NGF、GDNF、TGF-β mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),联合移植组次之.EPCs组中PDGF-BB、IGF-1、SDF-1 mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),联合移植组次之. 结论 BMSCs及EPCs联合静脉移植可上调脑内生长因子表达水平,为提高细胞移植效率提供了新的尝试途径.     

人胎盘底蜕膜间充质干细胞抗炎特性对帕金森病模型大鼠的神经保护作用

目的 研究人胎盘底蜕膜间充质干细胞(hPDB-MSCs)抗炎特性对帕金森病(PD)模型大鼠多巴胺能神经元的影响. 方法 体外培养hPDB-MSCs,6-羟基多巴(6-OHDA)制备大鼠PD模型并按照随机数字表法分为模型组与移植组,每组32只.hPDB-MSCs尾静脉移植观察各组大鼠行为学改变.免疫组化检测移植后3d、1周、2周及4周各组大鼠损伤侧黑质酪氨酸羟化酶(TH)、离子钙接头蛋白(Ibal)表达.实时荧光定量PCR检测各时间点各组大鼠损伤侧黑质抗炎因子人白细胞介素-10 (hIL-10)、人转化生长因子-β(hTGF-β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达. 结果 hPDB-MSCs移植后1周、2周、4周,移植组大鼠阿朴吗啡诱导的平均旋转圈数明显低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组化结果显示移植组大鼠损伤侧黑质部位TH阳性细胞数较模型组明显增加,1周、2周、4周时差异有统计学意义(P＜0.05).移植组大鼠损伤侧黑质部位Ibal阳性细胞则明显减少,4周时最为显著.mRNA水平,移植组大鼠hIL-10及hTGF-β表达均较模型组增加,而TNF-α表达量则逐渐降低. 结论 hPDB-MSCs尾静脉移植后能够通过抗炎机制抑制PD模型大鼠多巴胺能神经元丧失,改善PD模型大鼠症状.     

移植人羊膜间充质干细胞促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复

目的研究移植人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）是否促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复,探索其可能作用机制。 方法60只雌性SD大鼠按照随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组（30只）和hAMSCs治疗组（30只）。脊髓损伤采用脊髓撞击损伤模型,hAMSCs或PBS立刻移植到离脊髓损伤中心2 mm的头尾两端。免疫荧光检测细胞分化,血管再生和轴突再生。酶联免疫吸附剂测定试剂盒检测脑源性神经营养因子（BDNF）和血管内皮生长因子（VEGF）含量,BBB运动功能评分检测行为学。 结果在脊髓损伤后14 d、21 d和28 d,hAMSCs治疗组BBB评分分别为（8.75±0.701）、（10.375±0.532）和（12.125±0.350）,高于PBS组（6.0±0.463）、（7.25±0.412）和（9.125±0.440）,差异具有统计学意义（P<0.05）。在第7天和第14天,hAMSCs治疗组BDNF表达水平分别为（75.138±4.367）pg/mg和（66.483±4.099）pg/mg,高于PBS组（43.901±3.607）pg/mg和（41.108±3.848）pg/mg,差异具有统计学意义（P<0.05）。在第7天,第14天和第28天,hAMSCs治疗组VEGF表达水平分别为（23.328±2.463）pg/mg,（22.301±2.223）pg/mg和（14.855±1.282）pg/mg,高于PBS组（9.978±1.572）pg/mg,（9.271±1.496）pg/mg和（7.113±1.123）pg/mg,差异具有统计学意义（P<0.05）。hAMSCs治疗组血管数目（17.5±2.102）高于PBS组（6.25±1.750）,差异具有统计学意义（P<0.05）。hAMSCs治疗组小鼠抗5羟色胺阳性神经纤维面积（3486±203.643）和GAP43阳性神经纤维面积（4568.25±253.881）高于PBS组（2070.25±156.344）和（2455.725±314.475）,差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论移植hAMSCs能促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复,其作用机制可能是通过增加神经营养因子表达,促进血管再生和轴突再生。因此hAMSCs移植是治疗脊髓损伤的理想方法。     

Fas L转基因神经细胞异种移植治疗癫痫

目的以Fas配体转基因小鼠的胚胎海马神经细胞作为供体，异种移植治疗大鼠癫痫模型，研究Fas-配体表达对异种神经组织移植免疫排斥反应的影响。方法脑室注射海人酸损伤海马CA3区建立癫痫模型。转基因小鼠胚胎15d的海马组织移植到癫痫大鼠的双侧海马区。大鼠-大鼠同种移植组和野生型小鼠-大鼠异种移植组及生理盐水移植组作为对照。在移植后8周进行三等分臂迷宫和跳台实验检测癫痫模型的行为改善情况。结果RT-PCR检测移植的神经细胞中有人Fas配体的表达。转基因移植组与移植前相比有显著地改善（P〈0．01），异种移植及生理盐水组行为学无改善，转基因移植组与异种移植及生理盐水组相比有显著地改善（P〈0．01），但没有同种移植恢复的效果好。结论Fas配体的表达可以抑制或延缓宿主脑内对异种神经细胞的排斥反应。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑内出血

目的研究自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血大鼠的运动功能改善效果,以及采用不同移植方法后细胞在受损脑组织中的分布规律。方法采用立体定向技术向纹状体内注射自体新鲜心室腔血液构建SD大鼠脑出血模型,30只雄性SD大鼠随机分为A组:自然恢复组(对照组);B组:尾静脉移植组;C组:立体定向移植组,于移植后7 d、14 d进行神经功能缺损评分,并在荧光显微镜下观察BMSCs存活、迁移和分布情况。结果 C组大鼠神经功能恢复优于B组,BMSCs均能够迁移分布至大鼠脑损伤区。结论 BMSCs移植对脑出血后大鼠神经功能的恢复具有明显的促进作用。立体定向移植组大鼠神经功能恢复优于尾静脉移植组。     

微囊化异种坐骨神经组织细胞移植脊髓损伤大鼠核因子κB的表达

背景：核因子κB是一种重要的转录因子,在炎症反应中起重要作用。 目的：观察微囊化异种坐骨神经组织细胞移植于脊髓损伤大鼠后核因子κB的表达及活性变化。 方法：家兔用于制备异种坐骨神经组织细胞悬液。SD大鼠120只随机被分为4组。假手术组,建立大鼠脊髓半横断伤模型后分微囊组、细胞组、单损组。于损伤处分别植入明胶海绵吸附的10 μL 微囊化异种坐骨神经组织细胞、明胶海绵吸附的10 μL 异种坐骨神经组织细胞以及明胶海绵吸附的10 μL生理盐水。术后6,12,24 h,3,7,14 d,苏木精-伊红染色观察脊髓组织的病理学改变及免疫组织化学染色观察核因子κB的表达情况。 结果与结论：脊髓损伤大鼠神经元细胞浆及细胞核内核因子κB表达增加,24 h达高峰水平,3 d后开始逐渐降低,7 d基本降至正常。微囊组脊髓核因子κB阳性细胞的体积密度和表面积密度值均少于单损组、细胞组(P < 0.05)。 结果提示,微囊化异种坐骨神经组织细胞移植对脊髓损伤后核因子κB的活性表达起抑制作用,有益于减轻核因子κB介导的炎性反应。 关键词：微囊;核因子-κB;脊髓损伤;异种移植;SD大鼠 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.015     

骨髓间充质干细胞移植治疗对大鼠脑梗死后神经再生抑制因素的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)静脉移植对大鼠脑梗死后Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)蛋白的影响。方法实验动物分成假手术组、损伤对照组、溶剂对照组和移植组,各组再分为3d、7d、14d和21d组。全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,线栓法制作大鼠脑梗死模型。移植组自大鼠尾静脉注射BMSCs悬液1ml,溶剂对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。对各组动物进行神经功能缺损程度评分,免疫组化方法检测Nogo-A、OMgp和MAG的表达水平。结果移植组7、14和21d神经功能恢复优于对照组;移植组术后3、14和21d Nogo-A蛋白表达较对照组降低(P<0.05);移植组7、14和21d OMgp蛋白表达较对照组降低(P<0.05);移植组术后3、7、14和21d MAG蛋白表达较对照组降低(P<0.05)。结论 BMSCs移植可促进大鼠脑梗死后的神经功能恢复,其作用机制与下调Nogo-A、OMgp和MAG的表达有关。     

骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死的机制研究

目的 观察炎性因子和营养因子在静脉植入同种异体骨髓间充质干细胞(MSC)治疗大鼠脑梗死中的作用.方法 采用大脑中动脉远端阻塞法(dMCAO)制作大鼠脑梗死模型,假手术组开颅但不凝断血管、移植组于造模后1h经尾静脉移植1×106大鼠骨髓MSC,缺血对照组注射等量生理盐水.移植后48 h取脑用ELISA法检测皮层梗死核心区及纹状体促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6,抗炎因子IL-4、IL-10,以及营养因子IGF-1、GDNF、BDNF的含量.结果 同种异体骨髓MSC移植后48 h,和缺血对照组比较,移植组脑梗死区炎性因子IFN-γ、IL-6显著降低,TNF-α、IL-1β显著升高,纹状体区IL-10显著下降.移植组梗死区BDNF的含量比缺血对照组显著增高,纹状体区IGF-1的含量也比缺血对照组显著升高;GDNF在各组间无显著差异.结论 脑梗死后1h同种异体静脉移植骨髓MSC治疗dMCAO模型,其梗死后48 h时间点的治疗效果和MSC抑制炎性反应没有明确联系,而更可能和大鼠脑内营养性细胞因子增加有关.     

KLF7联合脂肪源性干细胞对小鼠坐骨神经缺损后轴突再生的影响

目的探讨核转录因子KLF7与脂肪源性干细胞(ADSC)联合应用对小鼠脱细胞同种异体神经支架(ANA)移植坐骨神经缺损后轴突再生和功能恢复的影响。方法成年C57BL/6小鼠随机分为脱细胞神经支架(ANA)组、ADSC组和KLF7+ADSC组,每组10只。坐骨神经功能指数(SFI)和电生理方法检测神经运动功能的恢复,Western bolt检测神经移植体内KLF7、Trk A和Trk B的蛋白表达。NF200免疫荧光法检测神经支架中轴突再生,并示踪PKH26标记的移植ADSC。结果与ADSC组比较,KLF7+ADSC组神经移植体内KLF7、Trk A和Trk B蛋白表达明显增高,NF200表达增强,PKH-26标记的ADSC数量显著增高(P0.05)。与ANA组比较,ADSC组和KLF7+ADSC组电生理波幅增高、神经传导速度增快、延迟期缩短,SFI功能指数增高,其中KLF7+ADSC组神经恢复作用显著优于ADSC组(P0.05)。结论 KLF7联合ADSC移植对小鼠ANA修复坐骨神经缺损后轴突再生和功能恢复的作用优于ADSC组,其机制可能与KLF7高表达促进神经移植体内Trk A和Trk B表达,进而促进移植的ADSC存活有关。     

胚胎神经干细胞对巨噬细胞分泌炎性反应因子的影响

目的探讨小鼠胚胎皮质来源的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性因子和一氧化氮(nitric oxide,NO)表达的影响。方法体外分离、培养NSCs与巨噬细胞。实验分组为NSCs组、小鼠骨髓来源巨噬细胞组(简称为巨噬细胞组)、小鼠骨髓来源巨噬细胞+NSCs非接触型共培养组(简称为非接触型共培养组)和小鼠骨髓来源巨噬细胞+NSCs接触型共培养组(简称为接触型共培养组)。培养24h后添加10ng/mL干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)再孵育24h后收集各组上清液,利用ELISA检测上清液炎性反应因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-10的表达,采用Griess法测量NO的表达水平。结果成功体外分离、培养原代NSCs和巨噬细胞。与巨噬细胞组相比,非接触型共培养组和接触型共培养组巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-1β明显下降,而IL-10明显增加(均P0.01)。与非接触型共培养组比较,接触型共培养组TNF-α降低〔(65.68±7.15)pg/mL比(90.99±5.57)pg/mL〕,IL-10升高〔(531.38±60.11)pg/mL比(324.32±45.41)pg/mL〕(均P0.01),而IL-1β和NO表达无统计学差异(P0.05)。结论 NSCs能够明显降低活化巨噬细胞NO和促炎性因子TNF-α、IL-1β的释放,增加抗炎性因子IL-10的分泌,减轻炎性反应程度,其机制可能主要通过NSCs分泌可溶性因子起作用。     

同基因造血干细胞移植治疗EAE小鼠脾脏Treg细胞的变化

目的 探讨Treg细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中变化和同基因造血干细胞移植治疗EAE小鼠巾的作用.方法 以MOG35-55免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型,分为病鼠-病鼠移植组、正常鼠-病鼠移植组和病鼠对照组.两移植组由EAE鼠和正常鼠做供体行移植后分3组,分别于移植后40d、80d、120d处死;病鼠对照组分4组,于移植前1d、移植后40d、80d、120d处死.流式细胞仪测定小鼠脾脏Treg细胞比例;实时定量聚合酶链反应测定脾脏Foxp3 mRNA水平;western blot法测定Foxp3蛋白水平.结果 移植前的病鼠对照组脾脏Treg细胞(3.3%±1.6%)较正常对照组(6.8%±1.7%)降低(P<0.05),移植后80d,两移植组Treg细胞(20.12%±2.67%、16.34%4±1.48%)上升至峰值(P<0.05);移植前的病鼠对照组Foxp3 mRNA相对表达量为0.48±0.19,移植后40d、80d、120d,两移植组Foxp3 mRNA均高于病鼠对照组(P<0.05);Foxp3蛋白水平为:移植前的病鼠对照组<正常对照组<移植后120d的移植组.结论 Treg细胞的数量减少和功能缺失可能与EAE发生发展有关;其数量增加和功能恢复可能是同基因造血干细胞移植治疗EAE的机制之一.     

胚胎干细胞在阿尔茨海默病小鼠中的移植研究

目的 观察胚胎干细胞移植至AD小鼠脑内后的分化情况和小鼠学习、记忆能力变化情况.方法 C57BL/6AD小鼠按随机数字表法分4组:(1)痴呆组(n=14),采用Ibotenic毁损右侧基底巨细胞核(NBM);(2)假手术组(n=14),于右侧NBM注射PBS;(3)移植组(n=12),于NBM毁损后4周移植胚胎干细胞;(4)正常对照组(n=14),不作任何处理.移植组额叶和顶叶皮质移植小鼠胚胎干细胞,术后12周应用HE染色和HuC/D-绿色荧光蛋白、GFAP-绿色荧光蛋白免疫双标染色观察胚胎干细胞的分化情况,以8方向迷宫评价小鼠的学习、记忆变化情况.结果 HE染色结果显示,各移植点胚胎干细胞均发展为恶性畸胎瘤,以额叶部位最为巨大;免疫双标染色未见HuC/D、GFPA表达.痴呆组小鼠的工作记忆错误(WME)值较正常对照组明显升高,比较差异有统计学意义(t=6.130,P=0.000).而移植组小鼠的WME值又较痴呆组小鼠明显升高,比较差异有统计学意义(t=6.460,P=0.000).各组小鼠的参考记忆错误(RWE)值差异无统计学意义(F=0.144,P=0.065).结论 胚胎干细胞移植至AD小鼠脑内移植未分化为神经元或胶质细胞,相反均发展为恶性畸胎瘤,小鼠的近事记忆损害明显加重.     

胚胎干细胞在阿尔茨海默病小鼠中的移植研究

目的 观察胚胎干细胞移植至AD小鼠脑内后的分化情况和小鼠学习、记忆能力变化情况.方法 C57BL/6AD小鼠按随机数字表法分4组:(1)痴呆组(n=14),采用Ibotenic毁损右侧基底巨细胞核(NBM);(2)假手术组(n=14),于右侧NBM注射PBS;(3)移植组(n=12),于NBM毁损后4周移植胚胎干细胞;(4)正常对照组(n=14),不作任何处理.移植组额叶和顶叶皮质移植小鼠胚胎干细胞,术后12周应用HE染色和HuC/D-绿色荧光蛋白、GFAP-绿色荧光蛋白免疫双标染色观察胚胎干细胞的分化情况,以8方向迷宫评价小鼠的学习、记忆变化情况.结果 HE染色结果显示,各移植点胚胎干细胞均发展为恶性畸胎瘤,以额叶部位最为巨大;免疫双标染色未见HuC/D、GFPA表达.痴呆组小鼠的工作记忆错误(WME)值较正常对照组明显升高,比较差异有统计学意义(t=6.130,P=0.000).而移植组小鼠的WME值又较痴呆组小鼠明显升高,比较差异有统计学意义(t=6.460,P=0.000).各组小鼠的参考记忆错误(RWE)值差异无统计学意义(F=0.144,P=0.065).结论 胚胎干细胞移植至AD小鼠脑内移植未分化为神经元或胶质细胞,相反均发展为恶性畸胎瘤,小鼠的近事记忆损害明显加重.     

毛蕊花糖苷通过下调TGF-β抑制胶质母细胞瘤上皮间质转化的实验研究

目的探讨毛蕊花糖苷(VB)对胶质母细胞瘤细胞上皮间质转化的作用及分子机制。方法(1)实验1:常规培养胶质母细胞瘤T98和U251细胞并各自分为4组,依次添加0、20、40、80μmol/L的VB处理24 h。采用CCK-8实验检测4组细胞存活率;采用Transwell实验检测4组细胞迁移、侵袭情况;采用RT-PCR实验及Western blotting实验检测4组细胞转化生长因子-β(TGF-β)、波形蛋白、Snail蛋白mRNA及蛋白表达情况。(2)实验2:T98、U251细胞各分为4组,依次为对照组、VB组、TGF-β组和TGF-β+VB组。对照组及VB组细胞转染空载质粒、TGF-β组及TGF-β+VB组细胞转染TGF-β质粒;转染24 h后VB组、TGF-β+VB组细胞均加入40μmol/L VB继续培养24 h,随后进行后续实验(迁移和侵袭实验、Western blotting实验,实验方法及检测指标同实验1)。(3)体内实验:裸鼠皮下种植U251细胞后分为2组,每组8只。实验组每天腹腔注射100 mg/kg的VB,对照组注射等量的PBS。记录小鼠肿瘤体积大小和小鼠体质量的变化;实验终点(移植后21 d)时,检测小鼠肿瘤重量并采用Western blotting实验检测肿瘤中TGF-β、波形蛋白、Snail的表达。结果(1)实验1:与0μmol/L VB组相比较,20μmol/L、40μmol/L VB组的细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05),而80μmol/L VB组细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.05);与0μmol/L VB组比较,20和40μmol/L VB组迁移和侵袭到下室的细胞随浓度的增高而减少,TGF-β、波形蛋白、Snail蛋白的mRNA和蛋白表达水平也依次降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)实验2:与对照组相比较,VB组细胞迁移和侵袭的细胞数量减少,TGF-β、波形蛋白及Snail蛋白的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);而TGF-β组细胞迁移和侵袭的细胞数量增加,TGF-β、波形蛋白及Snail蛋白的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);与VB组比较,TGF-β组及TGF-β+VB组细胞迁移和侵袭的细胞数量增加,TGF-β、波形蛋白及Snail蛋白的表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)体内实验:与对照组相比,实验组小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量更小,TGF-β、波形蛋白及Snail蛋白表达量更小,差异均有统计学意义(P<0.05);但2组小鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05)。结论VB通过下调TGF-β的表达而抑制胶质母细胞瘤的上皮间质转化。     

小鼠胚胎干细胞NT3基因转染后移植对脊髓损伤的恢复作用**☆

目的：由胚胎干细胞分化的神经细胞移植能够在一定程度上恢复脊髓损伤模型动物的功能，此发现使胚胎干细胞成为一种用于移植学研究的重要工具。观察经NT3基因转染修饰的小鼠MESPU35（ES-NT3）胚胎干细胞株移植对脊髓损伤动物脊髓结构和功能重建的恢复效果。 方法：实验于2004-09/12 在解放军第三军医大学组织胚胎学教研室实验室完成。①材料：清洁级成年Wistar大鼠36只，随机数字表法分为模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组，12只/组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。移植所用MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株均由本室冻存。②实验方法：复苏MESPU35和ES-NT3细胞株，采用经典维甲酸4-/4+法诱导两种胚胎干细胞神经定向分化，收集分化9 d后的细胞，调整细胞终浓度至5×1010 L－1备用。各组大鼠均建立L4 脊髓损伤模型，在脊髓完全横断后10 min内，基因转染细胞移植组分多点缓慢注入ES-NT3胚胎干细胞悬液， 2 μL/点，细胞总数约4×105个，注射位置为损伤区域白质与灰质交界处；未转染细胞移植组同法注射MESPU35胚胎干细胞悬液，模型对照组注射等量生理盐水。③实验评估：各组大鼠分别于术前、术后即刻、术后15 d和30 d进行后肢运动功能Tarlov评分检测，分数越低表示运动功能恢复越差。后肢运动功能检测30 min后进行斜板实验，检测大鼠抓握和维持姿势能力。微型注射器将25％的辣根过氧化物酶2μL注入大鼠坐骨神经内，2 d后取L1~L4脊髓常规冰冻切片，参照Mesulam法进行过氧化物酶逆行追踪。 结果：因细菌感染，模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组各死亡2只、1只、2只。①后肢运动功能检测：各组大鼠术后即刻后肢运动功能评分为0。术后15 d，30 d与模型对照组比较，未转染细胞移植组后肢运动功能评分升高(P < 0.01)，但未达到正常水平；基因转染细胞移植组恢复程度最高，后肢运动功能评分基本接近正常水平，明显高于未转染细胞移植组(P < 0.05)。②斜板试验：与后肢运动功能检测结果基本相似。③辣根过氧化物酶逆行追踪情况：模型对照组未见阳性神经元。术后30 d基因转染细胞移植组阳性神经元增至最多，脊髓结构恢复情况优于未转染细胞移植组。 结论：经NT3基因转染修饰的鼠MESPU35胚胎干细胞向神经定向诱导分化后，移植治疗脊髓损伤大鼠能更好地促进脊髓功能恢复和结构重建。     

脑源性神经营养因子基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞(MSCs)移植治疗大鼠脑出血的疗效.方法 分离培养大鼠MSCs;将带有BDNF的慢病毒载体转染MSCs;RT-PCR、蛋白质印迹检测转基因MSCs BDNF基因及蛋白水平表达.制备大鼠脑出血模型,采用抽签法随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、MSCs组、空病毒转染骨髓问质干细胞(MSCs-EGFP)组、脑源性神经营养因子基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞(MSCs-EGFP-BDNF)组,每组15只.72 h后细胞移植,记录各组细胞移植后7、14、21 d神经功能缺损改善程度;免疫荧光双标检测MSCs脑内迁移和分化情况.结果 MSCs-EGFP-BDNF组BDNF基因及蛋白水平表达明显高于MSCs组及MSCs-EGFP组;与PBS组(7 d:2.0±0.4,14 d:1.7 ±0.2,21 d:1.3±0.2)相比,MSCs组(7 d:1.6±0.2,14 d:1.2 ±0.3,21 d:0.8±0.2)、MSCs-EGFP组(7 d:1.6±0.3,14 d:1.1 ±0.2,21 d:0.8 ±0.3)及MSCs-EGFP-BDNF组(7 d:1.2±0.3,14 d:0.6±0.1,21 d:0.2 ±0.2)大鼠神经功能评分均有不同程度改善(F=6.667、18.417、20.882,均P＜0.05),其中MSCs-EGFP-BDNF组改善最为显著;免疫荧光双标显示MSCs-EGFP-BDNF组胶原纤维酸性蛋白、神经元特异性核蛋白、环核苷酸磷酸二酯酶阳性率明显高于MSCs组及MSCs-EGFP组,而MSCs组与MSCs-EGFP组比较差异无统计学意义.结论 BDNF基因重组慢病毒修饰的MSCs基因及蛋白水平表达均增高;修饰的MSCs移植后可迁移至脑出血灶周围存活并分化表达神经细胞标志物,促进脑出血后神经功能修复.