α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用,探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8,以Greiss法测定NO,RT-PCR检测组织因子(TF)mRNA,Westernblot检测TF蛋白表达。结果显示,α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α,但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TF mRNA,而α-MSH抑制这种上调作用,并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α-MSH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素（α—MSH）对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用，探讨α—MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α—MSH处理ECV304细胞，或在LPs／TNF-α处理的同时加不同浓度的α—MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8，以Greiss法测定NO，RT-PCR检测组织因子（TF）mRNA，Western blot检测TF蛋白表达。结果显示，α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α，但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TFmRNA，而α—MSH抑制这种上调作用，并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α—MsH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

海洋放线菌素X2下调柯萨奇病毒B3感染ECV304细胞ICAM-1的表达

目的:观察海洋放线菌素X2对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染ECV304细胞细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响。方法:采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和流式细胞术分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的ICAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果:CVB3感染ECV304细胞后,ICAM-1蛋白表达在12 h～54 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05);海洋放线菌素X2干预后,于12 h～54 h降低ICAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05);海洋放线菌素X2干预后,于24 h～54 h降低ICAM-1mRNA的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞ICAM-1的mRNA和蛋白的表达。     

ACTH(1-24)对脂多糖致ECV304细胞损伤的保护作用

目的研究ACTH(1-24)对脂多糖(LPS)损伤的脐静脉内皮细胞(ECV304)的保护作用。方法采用体外培养的ECV304为模型,分别观察对照组、LPS损伤组和ACTH(1-24)保护组的细胞活性及NO、TNF-α、细胞间黏附分子ICAM-1、核因子NF-κB家族成员p50、p52及趋化因子SCYA3、SCYB10的表达情况。结果LPS(50μg/ml)可使ECV304的细胞活性降低,细胞的NO、TNF-α、NF-κB、SCYA3、SCYB10及ICAM-1的表达增强。ACTH(1-24)可以提高损伤细胞的活性,抑制上述细胞因子的高表达。结论ACTH(1-24)可以阻断LPS对细胞的损伤,减少炎性介质和细胞因子的过度释放,对细胞具有明显的保护作用。     

HIV-1Nef调节内皮细胞黏附分子ICAM-1的表达

目的研究HIV-1的调节基因Nef对ECV304细胞ICAM-1表达的影响,从而为分析HIV-1感染引起内皮细胞生物学活性的变化,以及为阐明Nef参与HIV-1致病的分子机制奠定基础。方法应用本实验室已经建立保存的HIV-1Nef基因在内皮细胞的稳定表达细胞株ECV304-Nef和其阴性对照细胞株ECV304 pcDNA 3.1(+),通过RT-PCR、实时定量PCR(real-time PCR)、Western blot、FCM和细胞黏附试验分析ECV304-Nef细胞ICAM-1的表达水平。结果 RT-PCR、real-time PCR结果显示ECV304-Nef细胞ICAM-1 mRNA表达水平明显升高,为对照组的(4.3±0.2)倍;Western blot结果示ECV304-Nef细胞I-CAM-1蛋白的表达水平高于对照组;FCM分析显示ECV304-Nef细胞和对照组细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为(35.3±2.2)%和(12.5±0.8)%(P0.01),两组间ICAM-1表达有显著差异。细胞黏附实验观察到ECV304-Nef细胞黏附的Jurkat细胞数明显多于对照组,荧光仪定量分析结果显示ECV304-Nef细胞黏附的Jurkat细胞的荧光强度值显著高与对照组(P0.05)。结论本实验证实了HIV-1Nef基因可以上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达。     

LPS调节U937细胞上B7-H1表达的初步研究

目的了解脂多糖（LPS）刺激后U937细胞上B7-H1的表达变化情况。方法培养U937细胞,用荧光半定量实时PCR和流式细胞仪技术,分别观测未刺激和用LPS刺激的U937细胞B7-H1mRNA与蛋白的表达情况。结果未经刺激的U937细胞组成性表达B7-H1,LPS刺激可显著增强B7-H1基因mRNA的转录和蛋白的表达。结论LPS在转录与翻译两个环节均可上调U937细胞B7-H1的表达水平。     

HIV-1 Nef通过Erk/Mapk途径调节内皮细胞黏附分子ICAM-1的表达

目的:研究HIV-1Nef基因对内皮细胞ECV304细胞ICAM-1表达的影响及其信号途径。方法:选用Nef基因稳定表达细胞株ECV304-Nef和对照细胞株ECV304pcDNA3.1(+),应用Westernblot分析ECV304-Nef细胞ERK的磷酸化水平,利用ERK磷酸化抑制剂通过Westernblot、流式细胞术分析ECV304-Nef细胞ICAM-1的表达水平与信号分子ERK磷酸化的相关性。结果:Westernblot显示ECV304-Nef细胞ICAM-1和p-ERK蛋白的表达水平均高于对照组;流式细胞术检测结果表明ECV304-Nef细胞和对照组ICAM-1阳性细胞百分率分别为(35.3±2.2)%和(12.5±0.8)%(P0.01)。加入p-ERK抑制剂PD98059后,ECV304-Nef细胞p-ERK水平被显著抑制,ICAM-1降至对照组水平,ECV304-Nef细胞和对照组细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为(11.4±1.1)%和(10.4±1.5)%(P0.05)。结论:HIV-1Nef基因上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达与ERK信号分子磷酸化有关,为HIV-1感染的致病机制及临床治疗提供实验基础。     

海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响

目的研究柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB3)感染ECV304细胞后,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesionmolecule,VCAM-1)的表达变化及海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响。方法采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和FCM分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的VCAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3的SI为63.88。正常状态下ECV304细胞基本无VCAM-1 mRNA表达,CVB3感染ECV304细胞促进VCAM-1 mRNA表达,感染12 h达到最高峰,6～54 h时VCAM-1 mRNA水平,与细胞对照组相比CVB3感染组差异有统计学意义(P<0.05)。CVB3感染ECV304细胞后,VCAM-1蛋白表达在12～48 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05)。海洋放线菌素X2干预后,于12～54 h降低ECV304细胞VCAM-1 mRNA的水平,12～24 h降低VCAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表达。     

ERK信号转导途径在LPS诱导的人类内皮细胞iNOS表达中的作用

目的主要研究 p44/42MAPK(ERK1/2或ERK)信号途径在LPS诱导的人内皮细胞 -ECV304iNOS表达和NO产生中的作用。方法用Griess法检测细胞培养液中NO水平 ,分别用免疫荧光法和RT -PCR检测细胞iNOS蛋白和mRNA表达 ,采用免疫激酶沉淀以Westernblot检测细胞中ERK激酶的活性。结果LPS可显著激活人类内皮细胞 -ECV304中的ERK信号途径 ,其激活高峰在LPS刺激后15～20min ,45min后活性逐渐下降。用ERK的特异性抑制剂PD98059处理细胞后可以显著抑制LPS诱导人内皮细胞ERK的活性。与对照组相比 ,LPS刺激后的ECV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达明显增加 ,培养基中NO水平也显著升高 ,用PD98059预处理细胞后 ,可显著抑制细胞iNOS表达和NO和产生。研究结果表明ERK信号途径参与了LPS介导的人内皮细胞iNOS表达和NO产生。结论通过阻断信号转导通路来减少iNOS及其它细胞因子的产生 ,为败血症休克的防治提供了一条新的思路     

血小板内皮细胞黏附分子1、细胞间黏附分子3和CD44在体外淋巴管新生中的作用

目的 探讨内皮黏附分子血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、细胞间黏附分子3(ICAM-3)和CD44对淋巴管新生的作用。方法 用狗的胸导管分离和培养淋巴管内皮细胞。标记内皮细胞的PECAM-1、ICAM-3和CD44，在荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下观察。内皮细胞用肿瘤坏死因子(TNF-Ⅱ)或脂多糖(LPS)刺激后，再阻断PECAM-1、ICAM-3和CD44，作细胞计数和计算迁移率。制备三维凝胶淋巴管形成模型，观察管状结构的形成，测量其长度和面积，并在透射电镜下观察其特征。结果淋巴管内皮细胞表达PECAM-1：ICAM-3和CD44。在对照组以及TN-α和LPS刺激组，分别阻断PECAM-1、ICAM-3和CD44后，内皮细胞的迁移率降低，管样结构的长度和面积减少。阻断PECAM-1或CD44后，细胞的增殖数目降低，但阻断ICAM-3后细胞的增殖数目无明显变化。在半薄和超薄切片上，淋巴管内皮细胞形成的管状结构具有毛细淋巴管的形态特征。结论 体外培养的淋巴管内皮细胞表达PECAM-1、ICAM-3和CD44，这些黏附分子参与了淋巴管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等淋巴管新生过程。     

维生素D3诱导的U937细胞中CD14表达的实验研究

目的: 探讨维生素D3诱导U937细胞上CD14蛋白的表达及其对内毒素 (LPS)刺激的反应性。方法: 用0. 1μmol/LVitD3与U937细胞共同培养 24h诱导CD14基因的表达, 并观察U937细胞对不同浓度的LPS刺激不同时间的反应性。结果: VitD3能稳定诱导U937细胞表达CD14mRNA和CD14蛋白。经VitD3诱导的U937细胞对LPS刺激的敏感性显著增强, 表现为低浓度LPS刺激即能诱导该细胞核中NF -κB激活, 促进TNF- αmRNA的转录和表达, 并将表达的TNF α释放入培养上清中。结论: VitD3能诱导U937细胞中CD14基因和蛋白的表达, 并增加其对LPS刺激的反应性。     

CD14抑制肽对内毒素诱导U937细胞表达TNF-α的影响

目的 观察CD14抑制肽(CD14 inhibitory peptide,CD14-IP)对内毒素诱导的U937细胞表达TNF-α的影响.方法 U937细胞用佛波脂(PMA)诱导成熟后分5组:正常对照组、LPS组、高剂量抑制肽组、中剂量抑制肽组和低剂量抑制肽组.LPS组给予终浓度为100 ng/mL的LPS和100 ng/mL的LBP,高、中和低剂量抑制肽组除给予LPS和LBP外,分别给予终浓度为10 μg/mL、1.0 μg/mL和0.1 μg/mL的CD14-IP.ELISA测定细胞培养上清NNF-α的浓度.进一步观察不同时间应用CD14-IP(1.0 μg/mL)对LPS诱导U937细胞TNF-α和NTF-α mRNA表达的影响.用RT-PCR测定细胞TNF-α mRNA的表达.结果 LPS组和抑制肽各组TNF-α浓度较正常组明显增高(P<0.05),高、中剂量抑制肽组TNF-α水平比LPS组明显降低(P<0.05),高、中剂量抑制肽组之间TNF-α浓度无明显差别(P>0.05),低剂量抑制肽组TNF-α浓度与LPS组无统计学差异(P>0.05).不同时间应用CD14-IP时,CD14-IP早期应用对TNF-α和TNF-α mRNA的表达抑制作用显著.结论 CD14-IP能显著减少LPS诱导的U937细胞TNF-α和TNF-α mRNA的表达,早期应用效果较好,可能对LPS所致急性肺损伤有保护作用.     

牙龈卟啉单胞菌在单核细胞对内皮细胞黏附作用中的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)W83和ATCC33277株侵入在单核细胞对内皮细胞黏附作用中的影响,及在内皮细胞细胞间黏附分子l(ICAM-1)转录和翻译中的作用. 方法 建立体外P.gingivalis侵入内皮细胞模型,孟加拉玫瑰红活细胞染色法测定P.gingivalis侵入前后单核细胞对内皮细胞黏附的变化;RT-PCR和mRNA比色定量法检测内皮细胞ICAM-1基因表达;West-ern blot检测ICAM-1蛋白水平的变化. 结果 P.gingivalis W83和ATCC33277株侵入可增加单核细胞对内皮细胞的黏附,抗ICAM-1抗体部分抑制P.gingivalis侵入介导的单核细胞对内皮细胞黏附增加;P.gingivalis侵入上调内皮细胞ICAM-l基因和蛋白的表达,W83诱导单核细胞对内皮细胞黏附增强及内皮细胞ICAM-1表达的能力强于ATCC33277. 结论 ICAM-1在P.gingivalis介导的单核细胞对内皮细胞黏附增强过程中起部分作用,P.gingivalis侵入内皮细胞诱导ICAM-1表达可能是其诱发动脉粥样硬化疾病的机制之一.     

丹参酮Ⅱ A对LPS诱导EA.hy926细胞TLR4和TNF-α的影响

目的:观察丹参酮ⅡA对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926炎症反应Toll样受体4(TLR4)和TNFα表达的影响,探讨丹参酮ⅡA抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制.方法:体外培养EA.hy926细胞;RT-PCR和免疫细胞化学法检测TLR4 mRNA和蛋白的表达;RT-PCR和ELISA法检测TNF-αmRNA和蛋白的表达.结果:经LPS刺激后TLR4和TNF-α的表达与正常组比较均明显升高(P＜0.05),丹参酮ⅡA组TLR4和TNF-α的表达与刺激组相比明显受抑制(P＜0.05).结论:抑制TLR4和TNF-α的表达是丹参酮ⅡA抗AS作用的可能机制之一.     

胰岛素对TNF-α诱导U937细胞可溶性ICAM-1表达的影响

目的:探讨不同浓度的胰岛素和葡萄糖对TNF-α诱导单核细胞系U937可溶性ICAM-1表达的影响。方法:采用正交试验方法,将U937细胞置于含不同浓度(0、20、30、40和100mU/L)的胰岛素和不同浓度(5、10、20和30mmol/L)的葡萄糖及20μg/LTNF-α的RPMI1640培养液中培养。18h后,取培养液用ELISA法测定可溶性ICAM-1的水平。结果:U937细胞表达可溶性ICAM-1的水平随葡萄糖浓度的升高而增高,随胰岛素浓度的升高而下降。结论:胰岛素能抑制TNF-α诱导U937细胞表达可溶性ICAM-1。     

Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对ECV304内皮细胞增殖、黏附及炎症因子水平的影响。方法:ECV304细胞经TLR4 MIF单克隆抗体(mAb)和脂多糖(LPS)处理后,通过3H-TdR掺入实验、黏附实验和放射免疫分析研究细胞增殖、黏附和细胞因子水平。结果:LPS(10 mg/L)明显促进ECV304细胞TLR4的表达,而抗MIF mAb(10、50 mg/L)明显抑制其表达。抗MIF(50 mg/L)和抗TLR4mAb(1 mg/L)明显抑制了ECV304细胞的增殖,而LPS(10 mg/L)明显促进增殖。抗MIF mAb明显抑制了人外周血淋巴细胞对ECV304细胞的黏附,而LPS和抗TLR4 mAb对黏附无显著影响。抗MIF、抗TLR4 mAb明显抑制ECV304细胞TNFα的分泌,并呈剂量依赖,而LPS作用相反。与对照组相比,LPS(1 mg/L,48 h)可以促进ECV304细胞IL-8的分泌,抗MIF mAb(50 mg/L,48 h)可以明显抑制IL-8的分泌(P0.05)。但是抗TLR4 mAb(1 mg/L)对ECV304细胞IL-8的分泌无明显影响。结论:LPS、抗TLR4及抗MIF mAb对血管内皮细胞TLR4表达及活性有显著影响。     

免疫球蛋白IgG对TNF-α诱导的内皮细胞损伤的作用及其机制

目的探讨免疫球蛋白IgG对TNF-α诱导的内皮细胞黏附分子、细胞因子的表达及其作用机制。方法不同剂量的免疫球蛋白IgG预处理内皮细胞30 min,再加入TNF-α孵育2 h,或不同剂量的IgG与TNF-α预孵育30 min后加入内皮细胞孵育2 h,RT-PCR及实时定量PCR检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-Selectin及细胞因子IL-6、GM-CSF、IFN-β的mRNA表达;进一步应用Western blot检测黏附分子的蛋白表达及免疫球蛋白IgG自身抗体的表达情况。结果 IgG预处理内皮细胞再加入TNF-α或IgG与TNF-α预孵育后加入内皮细胞,IgG均可剂量依赖性地抑制了TNF-α诱导的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-Selectin)及细胞因子(IL-6、GM-CSF、IFN-β)的表达,IgG含有anti-IFN-γ,anti-TNF-α,anti-MCP-1的自身抗体。结论 IgG对TNF-α诱导的内皮细胞损伤有治疗作用,其机制与抑制内皮细胞分泌的黏附分子,细胞因子的表达及IgG存在抗细胞因子的自身抗体有关。     

干扰素-γ诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞表达细胞黏附因子-1和干扰素-γ受体α

目的 以体外培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMMVECs)为研究对象,探讨干扰素-γ(IFN-γ)对于体外培养的RIMMVECs表达细胞黏附因子-1(ICAM-1)和IFN-γ受体α(IFN-γRα)的影响.方法 体外分离培养RIMMVECs,用不同浓度的IFN-γ对所培养的RIMMVECs进行诱导,通过荧光定量RT-PCR法和流式细胞术,从mRNA和蛋白水平检测活化后的RIMMVECs表达ICAM-1和IFN-γRα的情况.结果 浓度为20 μg/L和40 μg/L的 IFN-γ可以激活RIMMVECs,在mRNA和蛋白水平均能提高ICAM-1的表达,并且6 h时达到高峰;20 μg/L的IFN-γ刺激RIMMVECs后,可使其上调表达IFN-γRα mRNA,但是蛋白表达量却随着刺激时间逐渐降低;而40 μg/L的IFN-γ刺激RIMMVECs 2 h后,IFN-γRα mRNA 达到峰值,6 h之后,其表达量呈下降趋势,IFN-γRα蛋白浓度也随之逐渐降低;10 μg/L的IFN-γ对于ICAM-1和IFN-γRα的表达无影响.结论 IFN-γ可能是通过影响微血管内皮细胞(MVECs)表面IFN-γRα分子和ICAM-1的表达,从而调控和参与细胞免疫反应和炎症反应.     

α-促黑素细胞激素抑制RAW264.7细胞产生炎症相关的免疫分子

目的 研究α-促黑素细胞激素（α-MSH）对巨噬细胞产生炎症相关的免疫分子的影响。探讨α-MSH的抗炎作用机制。方法 分别用LPS或α-MSH PLS处理体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,以Griess试剂测定NO,采用DADPH-黄递酶组织化学染色法检测iNOS,采用MTT法检测IL-1和TNF-α,采用ELISA法测定IL-6,细胞膜表面免疫相关分子的表达用FACS进行分析。结果 RAW264.7细胞在LPS刺激下产生NO、IL-1、IL-6和TNF-α显著增多,iNOS活性明显增强,细胞表面MHC Ⅱ、CD14、CD40、CD54、CD80和CD86分子表达水平增高;若在LPS刺激的同时给予α-MSH,能够抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO,IL-1、IL-6和TNF-α,使iNOS活性及表达MHCⅡ、CD14、CD40、CD54、CD86分子降低,但CD80分子降低不明显。结论 α-MSH抑制巨噬细胞产生NO、iNOS、前炎性细胞因子及表达膜表面免疫相关分子是其抗炎作用的重要机制之一。     

IL-18BP重组蛋白对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞的作用研究

目的探讨人重组白细胞介素-18结合蛋白(rhIL-18BP)对肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导的内皮细胞炎症、凋亡的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用20 ng/ml的TNF-α和不同质量浓度的rhIL-18BP孵育相应时间,提取mRNA并用PCR及实时定量PCR检测细胞因子(IL-6、IL-8)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)的mRNA表达;ELISA法检测细胞上清液中细胞因子(IL-6、IL-8)、可溶性黏附分子(sICAM-1、sVCAM-1)的蛋白含量;流式细胞术检测细胞凋亡的变化。结果 1)IL-18BP可以抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞中炎症因子的表达;2)IL-18BP能抑制TNF-α诱导的HUVECs的凋亡。结论 rhIL-18BP对TNF-α诱导的内皮炎症反应有抑制作用,并可以抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡。