阴道毛滴虫AK基因原核表达质粒的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kinase,以下简称AK)基因原核表达质粒并予以表达.方法 AK DNA的克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AKDNA片段,T4连接酶连接到含有2个酶切位点的原核表达载体PUC18,构建出重组原核表达质粒PUC18-AK,经PCR、酶切鉴定.重组质粒PUC18-AK经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在大肠埃希菌中进行初步表达.结果 AK基因体外扩增产物大小均为690 bp,重组原核表达质粒经PCR及酶切鉴定表明获得正确重组子.在大肠埃希菌中表达出AK蛋白,经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析与理论预测值相符.经蛋白质印迹法(westerm blotting)鉴定具有免疫原性.结论 成功地构建了AK基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达了AK蛋白.     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kimse,AK)基因真核表达载体并予以鉴定.方法 根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性.克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1( ),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1( )-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性.结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段.结论 成功地构建了基因真核表达载体.     

鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达

目的构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段,总长4.4kb,克隆至载体PCR2.1的SacI和NotI酶切位点,构建含1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒,并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体Lipo-fectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系（LMH）细胞中转染表达,收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定,证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明,该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体;通过电镜观察,转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论经体外重组,构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR2.1-DHBV1.5,并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制,从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。     

胸腺素α1重组原核表达质粒的克隆及诱导表达

目的：构建胸腺素α1（Tα1）基因的原核表达质粒，并诱导表达。方法：根据Tα1的DNA序列设计引物，采用PCR法扩增Tα1的cDNA，将其克隆入T-vector，形成中介重组体pT—Tα1，再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-3X，构建重组质粒pGEX-3X-Tα1，用内切酶酶切鉴定及DNA测序分析；将pGEX-3X-Tα1转入大肠杆菌，用RT-PCR方法检测宿主菌中Tα1mRNA，经IPTG诱导，用SDS—PAGE检测有无相应大小的Tα1融合蛋白表达。结果：经DNA测序和SDS—PAGE法鉴定，成功构建了Tα1重组质粒基因工程菌，表达和纯化了具有Tα1融合蛋白。结论：构建的Tα1重组质粒基因工程菌，表达和纯化了具有Tα1融合蛋白，为今后的研究打下了基础。     

5种食源性致病微生物毒力基因重组质粒的构建、克隆表达与表达产物的研究

目的构建大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌5种主要食源性致病微生物毒力基因重组质粒载体并鉴定其表达产物,为探讨高通量磁性荧光纳米颗粒标记相应的抗体技术快速检测带毒力基因的致病微生物的可行性奠定基础。方法分别从5种食源性致病微生物毒力岛中选择特异性的毒力基因进行引物设计,分别提取5种目的细菌DNA片段,经PCR扩增、电泳回收目的基因片段,将目的基因片段与原核表达载体pET-23a、pET-28a、pET-32a构建各自的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒载体,构建后的重组质粒进行酶切和测序鉴定,再转化入表达宿主E·coliBL21（DE3）。在0.1 mmol/L的IPTG诱导下,目的质粒载体在E·coliBL21（DE3）株中表达,SDS-PAGE电泳检测表达蛋白。结果实验成功构建大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌等细菌的毒力基因重组质粒载体pET-23a-eaeA、pET-28a-tdh、pET-28a-enterotoxin B、pET-32a-invA和pET-28a-ipaH,并克隆出969 bp的eaeA基因片段、567 bp的tdh基因片段、798 bp的enterotoxin B基因片段、1 041 bp的invA基因片段和771 bp的ipaH基因片段。重组质粒载体经酶切和测序与目标基因序列一致。在E·coliBL21（DE3）株中有质粒表达蛋白37.5 kDa（eaeA）、26 kDa（tdh）、34.5 kDa（enterotoxin B）、41 kDa（invA）、32 kDa（ipaH）。结论本研究成功构建了5种食源性致病微生物毒力基因重组质粒并在原核细胞中高效表达,为下一步获得相应的毒力基因抗体及快速诊断试剂的研制应用奠定了基础。     

人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建

目的利用分子生物学技术和方法将pRSET—A质粒改建为带有人α-防御素5（HD-5α）基因的新型表达载体pRSET—HD-5α。为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础。方法PCR技术，以设计的引物P1／P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段，并将扩增出来的目的基因和pRSET—A质粒用BamHI和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒，然后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆。最后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳。结果获得α-防御素-5基因片断大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET—A内。结论成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pR—SET—A／HD-5α。     

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从Ｂ型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了９３０ｂｐ的β－毒素基因。用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对ＰＣＲ产物进行双酶切处理，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒ｐＥＴ－２８Ｃ（＋）的多克隆位点，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和ＰＣＲ扩增检测。证明重组质粒ｐＥＣＢ２中含有产气荚膜梭菌的β－毒素基因。经核苷酸序列分析，明确了克隆的β－毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒ｐＸＳＴ１（带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ＳＴ基因），通过ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切处理，将切下的ＳＴ基因片段定向连接到ｐＥＣＢ２重组质粒中ＣＰＢ基因的下游。经特定酶切分析鉴定，得到了理想重组子质粒ｐＥＣＢＳＴ１，ＣＰＢ－ＳＴ融合基因在重组质粒ｐＥＣＴ－ＳＴ１中的连接向位是正确的     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

重组质粒pEGFP-N2-Wnt3a的构建和鉴定

目的构建大鼠Wnt3a真核表达重组质粒。方法从大鼠脊髓中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增编码大鼠Wnt3a的基因片段,应用基因重组技术将大鼠Wnt3a基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,经XhoI及EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得大鼠Wnt3a的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组质粒。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP-N2-Wnt3a经过鉴定,结构正确,为进一步转染骨髓基质干细胞(BMSCs)和脊髓损伤(SCI)治疗提供研究基础。     

CPB-ST融合基因的构建及表达研究

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ双酶切含有大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１前体蛋白基因的质粒ｐＸＳＴ１，回收３２５ｂｐ的ＳＴ基因片段，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的带有产气荚膜梭菌β－毒素基因（ＣＰＢ）的重组质粒ｐＥＣＢ２中ＣＰＢ基因的下降，转化受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切反应鉴定重组质粒，得到了理想重组质粒ｐＥＣＢ－ＳＴ１。重组菌株Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＣＢ－ＳＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ及ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以表达ＣＰＢ－ＳＴ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然β－毒素和ＳＴ１的生物毒性。     

TPT1真核表达载体的构建及在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的：构建TPT1真核表达载体，并转染肝癌细胞系SMMC-7721，为进一步研究奠定基础。方法：通过PCR的方法在TPT1 ORF（open reading frame，开放读码框）两侧添加EcoRI和BamHI的识别序列，将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中，构成pEGFP-N3TPT1重构体，卡那霉素筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，Sanger法测序，VeeScreen和BLAST分析测序结果，lipofeetAMINE转染肝癌细胞系SMMC-7721，荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达效率。结果：成功扩增了带有特异性核酸内切酶识别位点的TPT1 ORF片段，双酶切后连入pEGFP-N3，测序结果证明，rPT1正确插入pEGFP-N3中，转导SMMC-7721后，在荧光显微镜下，可见细胞发出明亮的绿色荧光，转染效率在30％左右。RT-PCR分析显示，pEGFP-N3TPT1转导的细胞，TPT1 mRNA水平较对照高0．78倍（P〈0．05）。结论：成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1，pEGFP-N3TPT1可在SMMC-7721细胞内高效表达。     

重组人促红细胞生成素四环素调控真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定含有四环素调控的pTRE顺式作用元件的质粒型载体pTRE2hyg-rhEPO。方法设计含BamHⅠ和ClaⅠ酶切位点的hEPO基因引物，采用RT-PCR法从含有rhEPO基因的CHO细胞中克隆hEPO基因片段，亚克隆至pTRE2hyg真核表达载体。转化感受态大肠杆菌Tbp10，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经RT-PCR能扩增出604bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论成功构建了重组人EPO四环素调控真核表达载体pTRE2hyg-rhEPO。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

表达人单核细胞趋化蛋白-1基因重组腺病毒的制备

目的制备表达人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)复制缺陷型重组腺病毒。方法RT-PCR法获得人肝组织中MCP-1cDNA片段,与T载体连接后亚克隆至腺病毒穿梭载体的巨细胞病毒启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-MCP-1,将其线性化后与pAdEasy-1共转化大肠杆菌B J5183,进行同源重组得到重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备复制缺陷型重组腺病毒,PCR扩增鉴定病毒颗粒。结果MCP-1重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,5 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定MCP-1基因片段。结论MCP-1重组腺病毒载体及相应重组腺病毒颗粒的成功构建和制备,为进一步研究MCP-1的作用及应用MCP-1进行基因治疗奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

表达人JNK基因重组腺病毒的构建和鉴定

目的 制备表达人c-jun氨基末端激酶(JNK)复制缺陷型重组腺病毒.方法 将重组穿梭载体pAdTrack-CMV-WT-JNK线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5138,进行同源重组得到重组腺病毒载体.将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备复制缺陷型重组腺病毒,并经PCR及DNA测序鉴定.结果 JNK重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,5 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定JNK基因片段并测序鉴定.动物实验证实构建的Ad-WT-JNK能有效在肝组织表达.结论 该研究成功构建了JNK重组腺病毒载体及相应重组腺病毒颗粒,为进一步研究JNK的作用及应用JNK进行相关疾病的基因治疗奠定了基础.     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。