siRNA介导的Bcl-2表达下调对肝癌细胞Hep3B的影响及对氨甲蝶呤化疗敏感性的影响

目的构建靶向Bcl-2基因的siRNA表达质粒,观察其对肝癌细胞Hep3B的影响及对氨甲蝶呤(MTX)化疗敏感性的影响。方法根据siRNA设计原则,设计并合成Bcl-2的siRNA序列,克隆到pRNAT-U6.1/Neo质粒U6启动子下游构建重组质粒;经序列分析确认质粒构建成功后,将重组质粒转染入人肝癌细胞Hep3B,通过RT-PCR、Western blot分析Bcl-2的表达,细胞生长实验分析其对肝癌细胞生长的影响及对MTX化疗敏感性的影响。结果重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-Bcl-2经过基因序列分析,siRNA片段成功插入,转染此质粒可使Bcl-2的翻译和蛋白表达水平一定程度的降低,并且可抑制Hep3B细胞的生长,增加其对MTX化疗的敏感性。结论成功构建并筛选出靶向Bcl-2基因的siRNA表达载体,它能抑制肝癌细胞Hep3B的生长及增加其对MTX化疗的敏感性,为基因治疗肝癌提供了新策略和实验基础。     

靶向GCSsi RNA表达载体与胃癌细胞耐药性

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）小干扰RNA（SiRNA）表达载体,观察其对胃癌耐药细胞（SGC7901/VCR）GCS基因表达和耐药性的影响。方法根据siRNA的设计原则,针对人GCS的mRNA序列设计并合成编码siRNA的寡核苷酸序列,并将其克隆入SiRNA的表达载体,构建重组质粒,将重组质粒转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901/VCR,通过蛋白印迹实验（WB）等方法检测转染细胞GCS的表达水平,采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测细胞耐药情况。结果构建的GCS siRNA表达载体经限制性酶切分析,证实释放出的片段大小与预期结果一致;转染SGC7901/VCR细胞后,可使细胞中GCS的表达受抑制,并使细胞对VCR的敏感性增加。结论GCS siRNA表达载体的成功构建及其对GCS表达的抑制和细胞耐药的逆转,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新手段。     

Nrf2基因沉默的人支气管上皮细胞模型的建立

目的构建沉默Nrf2(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2,Nrf2)基因表达的RNA干扰质粒,建立稳定转染Nrf2干扰质粒的人支气管上皮细胞株BEAS-2B(Human Bronchial Cells),并对其在该细胞中的沉默效果进行鉴定。方法根据Genbank上公布的人Nrf2核苷酸序列设计4条RNA抑制靶序列。化学合成后载入PGU6/RFP/Neo质粒载体构建成短发夹RNA(shRNA)表达载体,分别转染至BEAS-2B细胞,G418筛选稳定转染细胞株,RT-PCR(Real time-RCR)检测目标基因Nrf2的表达水平。结果成功构建shRNA质粒表达载体,G418浓度为400mg/L时能够筛选到稳定转染的细胞株,构建的稳定细胞系均能特异性的抑制Nrf2基因的表达。结论通过RNA干扰(RNA Interfering,RNAi)技术能够成功构建BEAS-2B细胞Nrf2下调表达的细胞模型,为研究Nrf2在肺癌抗氧化通路中的作用机制奠定了基础。     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。     

人卵泡抑素基因短发夹RNA表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果。方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质粒载体上,构建pLKO.1-FS-shRNA重组质粒,并进行酶切和测序鉴定。确认质粒构建成功后,用脂质体(Lipofectamine TM 2000)将重组质粒瞬时转染3AO人卵巢癌细胞系,并用实时定量反转录PCR法检测重组质粒对FS基因的表达抑制效果。结果:构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致;实时定量反转录PCR结果显示pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染的3AO人卵巢癌细胞后,细胞中的FS基因转录受到抑制,抑制率达59%。结论:成功构建了靶向人FS基因的shRNA干扰靶序列重组质粒(PLKO.1-FS-shRNA),转染后对人卵巢癌细胞系FS基因的表达具抑制效果,该实验为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础。     

RPL5蛋白重组质粒的构建、表达及细胞内定位

目的构建重组质粒载体pc DNA3.1-RPL5,观察核糖体蛋白L5(RPL5)在293T、Hep G2和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况。方法使用基因合成法合成RPL5基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,扩增后的目的基因双酶切后连接至pc DNA3.1载体的Bam HⅠ和NotⅠ位点之间,从而构建重组质粒pc DNA3.1-RPL5。将后者转化DH5α大肠杆菌,培养后挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳、测序比对等鉴定。采用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转染至293T、Hep G2和SMMC7721细胞株,激光共聚焦显微镜观察RPL5在此3种细胞中的表达和定位情况。结果重组质粒pc DNA3.1-RPL5经酶切电泳及DNA测序比对证实,目的基因RPL5的序列完全正确,重组质粒载体构建成功。激光共聚焦观察发现RPL5主要表达于293T、Hep G2和SMMC7721细胞的胞质中。结论成功构建pc DNA3.1-RPL5融合基因并在293T、Hep G2和SMMC7721细胞中表达,证实RPL5主要表达在真核细胞的细胞质中,为进一步探讨RPL5的生物学功能奠定了基础。     

Livin靶向RNA干扰对人胃癌细胞SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin靶向RNA干扰对SGC7901细胞株生物学特性的影响,探索胃癌基因治疗的新途径。方法设计和构建Livin特异性的siRNA真核表达载体,转染SGC7901细胞,应用RT-PCR分析LivinmRNA的表达情况,采用MTT法检测细胞的生长状况,通过流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。结果构建真核表达载体p-siRNA1并转染SGC7901细胞后,RT-PCR结果显示2条Livin siRNA真核表达质粒均能有效抑制Livin mRNA的转录表达,干扰组细胞与未转染组细胞比较,生长受到明显抑制,凋亡率明显增加。结论成功构建了Livin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人胃癌细胞Livin mRNA表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。     

psiRNA—hHDEK的构建及其对CasKi细胞生物学特性影响的研究

目的观察DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡、衰老的影响,为探索防治人类宫颈癌的新方法提供依据。方法根据siRNA设计原则和Genebank中DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiRNA-hHlneo中,应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western blot检测转染后DEKmRNA和蛋白表达,转染后48hMTr法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变、SA-β-半乳糖苷酶细胞化学染色鉴定细胞衰老。结果转染质粒psiRNA—hHDEK组DEKm RNA及蛋白的表达明显减少（0．28±0．02）,DEK基因沉默后CaSki细胞增殖能力下降,细胞周期阻抑,细胞凋亡率增加,衰老细胞增多。结论成功构建表达DEK siRNA的真核表达质粒psiRNA-hHDEK,并能够有效沉默CaSki细胞中DEK基因表达。DEK基因沉默后能够诱导CaSki细胞凋亡和细胞衰老。DEK基因在宫颈癌发生和演变中发挥重要作用,其既是衰老抑制基因,又是凋亡抑制基因。     

L-精氨酸转运体-2的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建氨基酸转运体-2(CAT-2)的靶向小分子干扰RNA(siRNA)表达载体质粒,并测序鉴定,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-argine/iNOS/NO通路的影响建立基础。方法:根据L-精氨酸转运体CAT-2的mRNA序列及siRNA设计原则,并经BLAST比对,设计合成4对siRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组质粒构建,将4对dsDNA分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细菌DH5。筛选阳性克隆并提取重组质粒后测序分析。结果:CAT-2的siRNA重组载体质粒测序结果证实表达载体构建成功。结论:L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体质粒成功构建,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-arg/iNOS/NO通路的影响建立基础。     

HBV核心抗原EGFP融合蛋白表达质粒的构建及在Hep G2细胞中的表达

目的探讨采用构建的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白的可行性.方法克隆HBV核心抗原基因进入真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体法转染HepG2细胞后在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白表达,并行RT-PCR及细胞免疫组化分析融合蛋白的表达.结果重组pHBc-EGFP质粒可在HepG2细胞内瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白融合蛋白.结论pHBc-EGFP质粒构建成功,增强型绿荧光蛋白的表达可报告HBV核心抗原表达.     

siRNA表达载体对大鼠心肌H9c2细胞牛磺酸合成限速酶-CSD基因表达的抑制作用

目的研究siRNA对大鼠心肌半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)的抑制作用。方法根据已克隆的大鼠心肌CSD基因序列(EU786150)设计并构建了4个siRNAs及1个阴性对照siRNA表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒siRNA1#、siRNA2#、siRNA3#、siRNA4#及阴性对照质粒分别转染H9c2细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、四唑盐(MTT)法检测H9c2细胞增殖情况、实时荧光定量PCR和Western-blot检测CSD mRNA和蛋白表达。结果荧光显微镜观察细胞转染效率达70%左右;与阴性对照组、未转染组比较,siRNA1#重组质粒显著抑制了H9c2细胞中CSD mRNA和蛋白的表达(P<0.05),而siRNA4#质粒对CSD表达无明显抑制效应(P>0.05);MTT检测结果表明转染重组质粒siRNA1#、siRNA2#进入H9c2细胞48 h、72 h后细胞增殖明显受抑制,与阴性对照组、未转染组相比差异均达到显著水平(P<0.05)。结论 siRNA1#重组质粒能有效抑制CSD基因的表达,且显著抑制H9c2细胞增殖,为研究CSD基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础。[营养学报,2012,34(4):317-321]     

ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体。方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRNcDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础。     

TGFβRⅡ-siRNA表达质粒构建及干扰效应鉴定

目的 通过构建转化生长因子βⅡ型受体小干扰RNA（TGFβRⅡ-siRNA）的表达质粒,观察其在肝星状细胞中对TGFβRⅡ的表达抑制效果,为研究其阻断肝纤维化作准备.方法 根据Ambion公司网上设计软件设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilenc er2.1-U6质粒中,以脂质体Metafectene 2000转染HSC-T6细胞,利用RT-PCR法和western-blot分别检测对TGFβRⅡ mRNA和蛋白干扰效果.结果 表达针对TGFβRⅡ-siRNA的siRNA-a和siRNA-b二个质粒是成功构建;与对照组相比,其对TGFβRⅡ mRNA表达分别下调到0.89±0.06和0.25±0.03,对TGFβRⅡ蛋白表达分别下调到0.86±0.05和0.23±0.02,转染siRNA-b质粒组显著抑制TGFβRⅡ mRNA和蛋白表达（均P〈0.01）,siRNA-a质粒组无统计学意义（均P〉0.05）.结论 TGFβRⅡ-siRNA能明显抑制TGFβRⅡ的表达.     

细胞穿透肽CCL融合蛋白的构建与表达

目的评估细胞穿透肽CCL融合蛋白构建的可能性。方法将CCL6 PEP 6XHis构建至pABP质粒，然后提取pABP CCL6 PEP质粒进行人胚肾HEK293细胞转染表达，以及CCL6 PEP 6XHis 蛋白层析纯化和检测。结果成功构建并纯化细胞穿透肽CCL融合蛋白。将CCL6 PEP 6XHis Tag 基因经PCR扩增、接入T 载体、克隆、培养，并提取质粒进行测序鉴定，所得序列与目的基因一致。成功将CCL6 PEP 6XHis基因构建至哺乳动物细胞表达载体pABP 中，经质粒提取和酶切鉴定，电泳结果显示，HindⅢ + XbaⅠ切出约430 bp的条带，符合预期，酶切鉴定正确。蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果阳性，表明纯化得到的目标蛋白带有hisx6标签。结论细胞穿透肽CCL融合蛋白能够人工构建，并通过真核细胞进行表达。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

siRNA抑制IKCa1基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:研究siRNA(small interfering RNA)抑制钙激活性中电导钾离子通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IKCa1)表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法:构建含有IKCa1基因的siRNA表达载体,脂质体法转染HeLa细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测HeLa细胞IKCa1 mRNA和蛋白表达变化;WST-1检测细胞增殖能力;流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化。结果:成功构建针对IKCa1基因的真核表达载体,所获表达载体转染HeLa细胞可使IKCa1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),并能有效抑制HeLa细胞增殖(P<0.05),使细胞周期停留在G0～G1期,S期细胞明显减少。结论:应用siRNA干扰技术能有效抑制IKCa1基因的表达,同时也可有效抑制宫颈癌HeLa细胞体外增殖活性。