胎儿骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞

目的探索体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为胰岛样细胞的最佳分化条件。方法取流产胎儿的长骨骨髓,体外培养扩增MSCs,先后予以2-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、B27及尼克酰胺,通过三阶段诱导MSCs分化为胰岛样细胞,观察细胞形态变化、免疫荧光鉴定巢素蛋白(nestin)、胰十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)、胰岛素(insu lin)和胰高糖素(glucagon)的表达、双硫腙染色鉴定胰岛细胞中的锌离子、电化学发光法测定人胰岛素的分泌量。结果MSCs易于体外分离和扩增,诱导二阶段细胞表达nestin及PDX-1,诱导三阶段形成胰岛样细胞团,表达insu lin及glucagon;双硫腙染色呈棕红色;胞浆胰岛素分泌量为81.3±23.6μu/m l;有一定程度葡萄糖刺激的胰岛素释放。结论MSCs可以诱导分化为胰岛样细胞团,尼克酰胺20 mmol/L是合适的促进胰岛细胞分化和成熟的浓度。     

体外冲击波干预成人骨髓间充质干细胞的形态学研究

目的通过观察体外冲击波干预骨髓间充质干细胞(hMSCs)后细胞形态学的变化,探讨体外冲击波(ESW)促进成骨的机理。方法用5 KV、100频次的理想体外冲击波干预第1代骨髓间充质干细胞,分别应用倒置相差显微镜投射电镜及HE染色观察细胞形态结构变化。结果体外冲击波对hMSCs增殖的影响显著,第3~5代hMSCs核分裂相增多,核浆比加大,增殖高峰提前,细胞簇集融合,呈放射状扩展;第7~9代细胞体积增大明显,内质网扩张成池,高尔基器发达,条带状交错成片,基质堆积成束,方向性明显,具有成熟细胞的表现;第11代仍有呈对称分裂细胞,表现出定向成骨分化的潜能。结论ESW干预能够提高hMSCs的增殖和分化能力。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

骨髓间充质干细胞促进异基因骨髓移植后造血恢复

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMMSC)对异基因骨髓移植小鼠造血功能恢复的影响。方法将供鼠C57BL/6(H-2b)的骨髓细胞和体外培养的BMMSC联合输给致死量照射的受鼠BalB/c(H-2d)。在移植后第1、7、14天检测受鼠外周血红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(BPC);移植后第7、14天检测受鼠骨髓中的脾集落形成单位(CFU-S)。结果联合移植组小鼠第7、14天的外周血红细胞、白细胞、血小板、CFU-S数均显著高于单纯移植组(P<0.01)。结论BMMSC能促进异基因骨髓移植后造血功能重建。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外生长增殖特点的实验研究

目的 了解应用全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长、增殖特点,以及接种密度、培养时间对细胞增殖的影响,为预防和治疗机体退行性疾病等提供多潜能的种子细胞.方法 通过全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,在体外条件下培养,应用倒置显微镜观察细胞形态学特征及流式细胞仪鉴定、检测大鼠BMSCs表面标志抗原,并通过分析对接种于96孔板不同接种密度(2×103、5×103、1×104个细胞/ml)连续培养10 d细胞生长曲线的特点,研究接种密度和培养时间对BMSCs生长、增殖的影响.结果 流式细胞仪分析CD29细胞阳性率为97.68%(7607/7788),CD34、CD45细胞阳性率分别为7.93%(661/8340)、2.76%(215/7788),符合BMSCs表面标记物表达特征.通过换液及消化传代,3代以上的BMSCs较为均一纯化,呈典型的旋涡或放射状生长,约传代至7～10代时出现细胞衰老并衰老细胞逐渐增多;中等密度(5×103个细胞/ml)接种细胞的生长曲线呈较典型的S形曲线.第1、2天为潜伏期;第3～5天为对数生长期;第6天细胞数目进入平台期;第8～10天细胞数量稍有下降.结论 全骨髓贴壁法是获得BMSCs较为简便有效的方法,且中等量接种密度更有利于细胞增殖,可获得更多的种子细胞.     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞成骨分化比较的体外研究

目的对骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞（AMscs）成骨能力进行比较。方法采用钙钴法染色、四环素荧光标记、Ⅰ型胶原染色、茜素红染色、碱性磷酸酶测定，比较脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞成骨能力。结果两种细胞诱导3周后，茜素红染色出现淡红色钙结节；四环素荧光染色出现明亮黄色荧光钙结节。改良钙钴法染色，细胞胞浆中出现黑色颗粒。结论（1）AMSCs向成骨诱导后，可表达Ⅰ型胶原、ALP，并出现钙结节。（2）AMSCs经过诱导后，可向成骨细胞方向分化。     

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

CFSE标记对兔骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记兔骨髓间充质干细胞(Rb-MSCs)的条件及其对Rb-MSCs生物学特性的影响.方法 用全骨髓贴壁法分离纯化Rb-MSCs并进行鉴定;CFSE在不同条件下标记Rb-MSCs,流式细胞仪检测标记率及荧光强度;CCK-8法检测标记细胞的增殖能力,成骨成脂诱导检测标记细胞的分化能力,ELISA法检测标记细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的能力.结果 原代Rb-MSCs呈梭形,集落样生长;传代后细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样,流式细胞仪检测其表面标志物符合MSCs表型.与其它标记条件相比,10 μmol/L终浓度CFSE标记Rb-MSCs 10 min,标记率达100％,且荧光强度高.标记细胞的增殖能力及分泌VEGF的能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05);且标记细胞具有成骨及成脂的分化能力.结论 CFSE标记Rb-MSCs是一种简单且高效的方法,适用于短期标记.且标记后Rb-MSCs的增殖能力、分化能力及分泌能力不受影响.     

绿色荧光蛋白报告基因转染示踪体内骨髓间充质干细胞的分化

目的用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨中种子细胞的变化与转归。方法用腺病毒载体Adeno-XTM将GFP基因转染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),成骨诱导培养3周后将其接种于磷酸钙/纤维蛋白胶复合支架材料,构建成组织工程化骨,回植于供体兔皮下。术后4周,激光共聚焦显微镜下示踪观察GFP,测定碱性磷酸酶(ALP)活性,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素(OCN)和HE染色观察组织结构。结果4周后,大体可见组织工程化新骨形成;组织学显示新生骨围绕材料孔隙生成,磷酸钙/纤维蛋白胶复合材料部分降解;ALP活性明显增高;Ⅰ型胶原、OCN免疫组化染色阳性;新生组织内见GFP标记细胞。结论组织工程化骨组织结构与松质骨小梁类似;新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于接种细胞。     

神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养的实验研究

目的 探讨神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养对神经干细胞分化为神经元的影响.方法 将纯化的神经干细胞和骨髓间充质干细胞混合培养,观察神经干细胞的分化状态,应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定.结果 共培养组中36.35%±4.63%的细胞表达神经元特异性蛋白NSE,明显高于对照组中12.78%±6.91%的表达率.结论 骨髓间充质干细胞能提高神经干细胞分化为神经元的比例,还能延长神经元的存活时间.     

SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的可行性.方法 利用电转法将SHH基因转染人大鼠骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察转染效率;分别绘制未转染及转染SHH基因后细胞生长曲线,观察转染对细胞的影响;采用PCR、RT-PCR、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞中外源性SHH基因的表达情况.结果 生长曲线显示转染后骨髓间充质干细胞生长曲线指数生长期及平台期延后,在转染后第12天与未转染达到一致.转染后48 h(即将用于移植前),经荧光倒置显微镜观察转染效率为30％,PCR检测转染后骨髓间充质干细胞中SHH表达较未转染细胞明显升高,实时定量PCR检测其升高约7倍左右,通过Western-blot检测转染后SHH蛋白产物表达明显升高.结论 电转法能够有效将外源性SHH基因转染人大鼠MSC并能获得有效表达,为进一步大鼠缺血性心脏病模型的在体基因治疗提供了前提基础.     

骨髓间充质干细胞诱导抗砷细胞

目的利用低剂量NaAsO2诱导骨髓间充质干细胞MSCs,获得抗砷细胞,探讨抗砷机制。方法用1μmol/L NaAsO2对MSCs进行低剂量慢性诱导,利用四甲基偶氮噻唑蓝法(MTT)计算细胞生存率及半数致死量,观察细胞抗砷性的产生。结果NaAsO2诱导18周后,人骨髓MSCs产生稳定抗砷性,砷诱导组细胞LC50为25.8μmol/L,同步对照组细胞LC50为11.4μmol/L,砷诱导组细胞LC50是同步对照组细胞LC50的2.2倍。结论低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓MSCs,可使细胞获得抗砷性。     

与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞弹性蛋白、LOX及Fibulin-5mRNA表达的影响

目的:研究与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的影响,探索在体外条件下诱导BMSCs向韧带成纤维细胞分化微环境的创建并检测诱导分化细胞内弹性蛋白、LOX、Fibulin-5的表达。方法:选择7天SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定;取大鼠盆底韧带组织,自行分离传代,获得大鼠盆底韧带成纤维细胞;取纯化的第四代盆底韧带成纤维细胞与纯化培养后的第四代骨髓间充质干细胞间接共培养;实时定量RT-PCR检测弹性蛋白、LOX及Fibulin-5在不同共培养天数BMSCs中mRNA的表达情况。结果:与相应天数阴性对照组相比,3天共培养组弹性蛋白、LOX、Fbulin-5 mRNA的表达量增加,但均无显著变化(P>0.05),6、12天共培养组mRNA的表达量均显著增高(P<0.05);与3天对照组相比,6天对照组和12天对照组的表达量均无显著变化(P>0.05);与3天共培养组相比,6天共培养组的表达量增高,但差异无统计学意义(P>0.05),12天共培养组的表达量均有显著增高(P<0.05)。结论:与盆底韧带成纤维细胞间接共培养可以促进BMSCs弹性蛋白、LOX、Fbulin-5mRNA的表达,这一结果为BMSCs作为韧带组织工程的种子细胞在体外诱导分化条件的探索提供了一条新的研究思路。     

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562细胞株药物耐受性的影响

目的 研究急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞（MSCs）对K562细胞药物耐受性的影响,并初步探讨其机制.方法 从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSCs;建立K562细胞株与MSCs共培养的体系,观察MSCs对K562细胞生长的影响;AnnexinV-FITC检测一定浓度的阿霉素（ADM）对K562细胞凋亡的影响;流式细胞仪测定不同培养条件下的K562细胞周期;RT-PCR检测K562细胞的Bcl-2和Bax基因.结果 和单独培养的K562细胞相比,与MSCs黏附共培养的K562细胞生长较为缓慢,未见明显的对数生长期.单独培养组细胞早期凋亡率为（9.19±0.53）%,而黏附培养组为（4.00±0.37）%,差异具有统计学意义（P＜0.05）.黏附共培养组K562细胞,G0-G1期细胞比例为（80.95±3.83）%,显著高于单独培养组（50.2±2.26）%（P＜0.05）;而S期细胞比例为（17.40±1.50）%,显著低于单独培养组（37.03±3.50）%（P＜0.05）.相对于单独悬浮培养的K562细胞,黏附共培养的K562细胞Bcl-2基因相对表达明显增强,Bcl-2/Bax显著增高.结论 白血病患儿MSCs能抑制白血病细胞株K562生长,改变细胞周期而逃避药物的促凋亡作用,K562对阿霉素产生耐药性可能与黏附共培养后Bcl-2基因表达增强有关.