运动员骨关节损伤体外细胞成骨分化机制探讨

目的 通过体外实验探讨P物质受体NK1(NK1-R)在骨髓间充质干细胞（大鼠骨髓基质干细胞，ST2）中的表达及其与成骨分化标记物的关系。方法 将骨髓间充质干细胞（ST2）细胞株接种于培养皿传代培养，培养基为高糖DMEM培养基（含10%FBS），放置于5%CO2细胞培养箱中37°C孵育72 h传代，至第三四代时使用。实验组加入含10-6mol/L浓度的P物质的成骨诱导培养液，对照组为不含P物质的成骨诱导培养液，培养7天，分别在第1,3,5,7天收获细胞进行NK1受体的免疫细胞化学染色，分析其阳性表达率。同一批细胞在1,3,5,7天收获细胞培养液，用ELISA检测ALP、OCN（骨钙素），分析其表达量的变化。结果 细胞免疫化学显示第1天时NK1受体即开始表达，第3,5天表达上升，1周时NK1受体明显表达，其存在于细胞膜和细胞质，主要存在于细胞质中，成骨分化标记物中成骨分化早期标记物ALP第1,3,5,7天表达量为1.695 ng/ml,5.013 ng/ml,7.94 ng/ml和9.932 ng/ml，随着时间推移表达量逐渐增加，成骨分化晚期标记物OCN在1,3,5天表达量很少，分别为1...     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外生长增殖特点的实验研究

目的 了解应用全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长、增殖特点,以及接种密度、培养时间对细胞增殖的影响,为预防和治疗机体退行性疾病等提供多潜能的种子细胞.方法 通过全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,在体外条件下培养,应用倒置显微镜观察细胞形态学特征及流式细胞仪鉴定、检测大鼠BMSCs表面标志抗原,并通过分析对接种于96孔板不同接种密度(2×103、5×103、1×104个细胞/ml)连续培养10 d细胞生长曲线的特点,研究接种密度和培养时间对BMSCs生长、增殖的影响.结果 流式细胞仪分析CD29细胞阳性率为97.68%(7607/7788),CD34、CD45细胞阳性率分别为7.93%(661/8340)、2.76%(215/7788),符合BMSCs表面标记物表达特征.通过换液及消化传代,3代以上的BMSCs较为均一纯化,呈典型的旋涡或放射状生长,约传代至7～10代时出现细胞衰老并衰老细胞逐渐增多;中等密度(5×103个细胞/ml)接种细胞的生长曲线呈较典型的S形曲线.第1、2天为潜伏期;第3～5天为对数生长期;第6天细胞数目进入平台期;第8～10天细胞数量稍有下降.结论 全骨髓贴壁法是获得BMSCs较为简便有效的方法,且中等量接种密度更有利于细胞增殖,可获得更多的种子细胞.     

个旧矿粉诱导的肺癌细胞中分化抗原9的表达及基因突变分析

目的探讨分化抗原9（CD9）在个旧矿粉诱导永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B）恶性转化为肺癌细胞过程中的异常表达和基因突变。方法以BEAS-2B为对照组（20瓶），以个旧矿粉体外诱导BEAS-2B所产生的恶性转化细胞为实验组（20瓶）。采用免疫细胞化学技术检测CD9蛋白在BEAS-2B和恶性转化细胞中的表达。采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测CD9mRNA在BEA-2B和恶性转化细胞中的表达；并对其RT-PCR产物进行DNA序列测定。结果CD9蛋白在BEAS-2B中的表达率（100％，20／20）与其在恶性转化细胞中的表达率（35％，7／20）差异有统计学意义（P〈0．01）。CD9mRNA在BEAS-2B中的表达强度（0．91±0．09）明显高于其在恶性转化细胞中的表达强度（0．34±0．14），差异有统计学意义（P〈0．01）。DNA序列测定显示，在BEAS-B的恶性转化细胞中CD9基因存在2处点突变，在第231位置发生G—T转换；在第119位置发生T→A转换，而且这2处的替代引起的错译突变均导致了编码氨基酸的改变，第40位氨基酸由谷胺酰胺（Gin，Q）变为组氨酸（His，H）；第3位氨基酸由缬氨酸（Va1，V）变为天冬氨酸（Asp，D）。结论CD9的表达缺失或下调以及基因突变在个旧矿粉诱导BEAS．2B恶性转化为肺癌细胞的过程中可能发挥重要作用。     

丙型肝炎病毒F蛋白体外免疫调节作用

目的探讨HCVF蛋白对DC及T细胞的免疫调节作用。方法构建HCVF蛋白的表达菌株,并表达、纯化F蛋白;收集42例慢性丙型肝炎患者及30例健康对照,检测血清抗F蛋白抗体的阳性率;分离PBMC,并体外诱导分化DC细胞,用纯化的F蛋白刺激DC细胞,流式细胞术检测DC细胞表面CD69、CD80、CD95、CD95L的表达情况;用纯化的F蛋白刺激PBMC,ELISA方法检测细胞上清中IFNγ、IL-12、IL-4、IL-10的含量。结果成功克隆表达F蛋白,纯度较高（浓度0．8mg／mL,纯度大于90％）;42例慢性丙型肝炎患者m清中特异性抗F蛋白抗体阳性率为42．88％（18／42）;F蛋白可诱导DC细胞表面CD69、CD80、CD95L、CD95明显上调．且丙型肝炎患者这些分子的表达水平明最高于健康对照组（t=2．824、3．707、4．788、3．550,P均〈0．05）。F蛋白诱导丙型肝炎患者PBMC产生的Th1型细胞因子IFNγ、IL-12含量明显低于健康对照组（t=4．583、3．708,P均〈O．05）,而Th2型细胞因子IL-4、IL-10含量明显高于健康对照组（t=3．483、2．872,P均〈0．05）。结论丙型肝炎F蛋白可诱导机体产生特异性抗体,上凋DC细胞表面活化及凋亡分子．并可促进Th1／Th2失衡。     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人肺癌细胞的表达及其检测

目的：选择已分离鉴定的人巨细胞肺癌细胞高转移亚型PGBEl，转染肿瘤转移抑制基因nm23-H1，以获得稳定表达nm23-H1基因的人肺癌细胞株。方法：采用亚克隆方法获得pcDNA3．1（-）／nm23-H1真核表达载体并进行双酶切和测序鉴定；应用脂质体转染法将重组质粒转染PGBE1细胞；用G418筛选获得阳性细胞克隆，命名为pcDNA3．1（-）／nm23-H1-PGBE1细胞株；用RT-PCR法半定量检测nm23-H1基因的mRNA表达水平和免疫组化法检测nm23-H1基因的蛋白质表达。结果：真核表达载体pcDNA3．1（-）中正确插入了具有完整阅读框的nm23-H1基因；倒置显微镜下观察到经G418筛选出的稳定转染的PGBE1细胞，形成“小岛”；RT-PCR和免疫组化显示转染的细胞中nm23-H1 mRNA和蛋白质水平表达均增高。结论：建立了稳定表达nm23-H1基因的PGBE1转染细胞株，可用于进一步研究肿瘤转移的分子机制。     

细胞表面分子在间充质干细胞对T细胞调节机制中的作用

目的探索细胞表面免疫分子在间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）对T细胞的免疫调节机制中的作用。方法分离、培养和鉴定MSC和T细胞；电镜观察MSC和T细胞共同培养时的相互作用；检测MSC对T细胞表面分子CD54，程序性死亡受体（programmed cell death ligand，PDL）-1，组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）-I，MHC—II表达的影响。结果MSC与T细胞共培养时，大量MSC和T细胞连接在一起：T细胞表面分子的表达率：离体实验一买验组：CD54：（66．0±1．3）％；PDL-1：（61．0±19）％，MHC－I：（23．4±3．4）％，MHC－II：（27．5±1．2）％；对照组：CD54：（52．1±2．0）％，PDL-1：（42．1±2．0）％，MHC－I：（19．5±3．0）％，MHC－II：（9．2±0．8）％；在体实验一实验组：CD54：（59．0±2．6）％；PDL－l：（57．4±2．4）％；MHC－I：（22．6±2．7）％；MHC-II：（22．4±2．0）％；对照组：CD54：（51．5±1．0）％，PDL-1：（50．0±3．3）％，MHC－I：（18．1±1．5）％，MHC－II：（9．7±0．6）％。结论MSC与T细胞相互接触后促进T细胞表达CD54，PDL-1，MHc－I，MHC－II，这可能在MSC对T细胞免疫调节作用中发挥重要作用。     

SD大鼠骨髓基质细胞的分离培养和鉴定

目的观察SD大鼠骨髓基质细胞的体外分离培养情况并加以鉴定。方法采用密度梯度离心(Percoll法)和贴壁培养结合的方法分离培养SD大鼠BMSCs;采用倒置相差显微镜观察BMSCs形态学特征;流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD45和CD90表达阳性率。结果第3代以后的细胞形态较一致,呈大而扁的梭形为主,第3～5代细胞增殖力保持旺盛;第3代细胞表面标志抗原CD45和CD90表达阳性率分别为:0.2%和94.7%。结论密度梯度离心结合贴壁培养的方法可获得较高纯度的BMSCs,对其进行研究和应用应选用第3～5代的BMSCs。     

新生儿脐带血CD4＋CD25high调节性T细胞Foxp3的表达探析

目的：对新生儿脐带血CD4＋CD25high细胞中调节性Treg细胞的Foxp3表达进行研究。方法：采用密度梯度离心法提取新生儿（A组）脐带与成年人（B组）外周血液中的单个细胞核后，使用流式细胞仪测定CD4＋CD25high细胞中的Treg细胞数量，并对细胞内的转录因子（Foxp3）进行检测，并记录检测结果。结果：A组CD3＋CD4＋细胞中Treg细胞所占比例为（3．86±1．63）％，明显高于B组的（0．87±0．74）％：A组Treg细胞中表达Foxp3的比例为（23．21±8．9）％，明显低于B组的（71．3±11．6）％，差异均有统计学意义（P〈O．01）。结论：虽然新生儿脐带血中CD4＋CD25high的细胞数量较高，但新生儿Foxp3细胞相对于成年人却相对较低，这也进一步说明新生儿Treg细胞的Foxp3表达能力尚未完全发育并未成熟。     

人肺腺癌肿瘤细胞免疫表型CDl33、CD34、CD44的实验研究

目的拟验证CDl33、CD34、CD44作为人肺腺癌肿瘤干细胞表面标记物的合理性。方法采集新鲜肺腺癌组织标本,利用两种体外培养方法扩增出贴壁细胞和悬浮细胞球两种肿瘤细胞,采用免疫荧光检测比较CDl33、CD34和CD44在两种培养细胞中表达的差异。结果悬浮球肿瘤细胞培养较贴壁肿瘤细胞生长速度慢、维持时间长且成功率高（72．5％VS47．5％,P〈0．05）。CDl33、CD34和CD44在悬浮细胞球中表达率和表达量明显高于贴壁肿瘤细胞（68．97％,82．76％,93．10％VS5．26％,15．79％,5．26％,P〈0．01）。结论CDl33、CD34和CD44可能作为分离人肺腺癌肿瘤干细胞的表面蛋白表标记组合。     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

上皮性卵巢癌患者外周血CD4~+CD25~(high)调节性T细胞分析

目的探讨CD4+CD25highT细胞(Treg)在60例上皮性卵巢癌患者外周血中的分布及其表型特征,分析手术对卵巢癌患者外周血Treg的影响。方法采用流式细胞术检测卵巢癌患者及健康人外周血中Treg的比例,探讨其表型特征并分析手术对患者外周血Treg比例的影响。结果与正常对照(2.95±1.09)%相比,60例上皮性卵巢癌患者外周血中Treg比例明显增加(9.81±5.19)%,二者差异有统计学意义(P0.01);手术后,患者外周血中Treg的比例相比术前显著下降(P0.01);Treg表型分析发现:Treg高表达CD45RO、HLA-Ⅰ、Foxp3分子,较高水平表达OX40、GITR、CD152、CD95、CD95L、B7-H1,几乎不表达CD80、CD86、B7-H4、CD45RA、CD69分子,而HLA-DR、CD154的表达水平在个体间差异较大,同时大部分Treg细胞CD127表达阴性。结论上皮性卵巢癌患者外周血CD4+CD25highT细胞水平明显升高,可能参与卵巢癌患者肿瘤免疫抑制。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

TNF-α对大鼠骨髓间充质干细胞黏附分子L-选择素表达的影响

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）经不同浓度的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）预处理后,表面的黏附分子L-选择素（L-selectin,CD62L）的表达变化以及其表达变化与细胞因子浓度之间的关系.方法 采用等密度梯度离心法收集大鼠MSCs并用贴壁培养法进行扩增纯化,经免疫组化法鉴定后,加入不同浓度TNF-α分别作用24小时,将其消化分离和标记后,采用流式细胞仪（flow cytometer,FCM）对其表面的CD62L的表达进行检测.结果 经TNF-α预处理24小时的大鼠MSCs经流式细胞仪检测,其表面CD62L成阳性表达的细胞占所检测细胞的百分比与未加入任何细胞因子预处理的空白组大鼠MSC相比较,差异显著,不同浓度组间比较,差异显著.结论 经不同浓度TNF-α预处理的大鼠MSCs表面CD62L表达较空白组要高,并且随着TNF-α浓度的升高大鼠MSCs表面CD62L的表达也相应升高.     

CD133、CD90在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的检测肝癌干细胞标志物CD133和CD90在原发性肝癌组织中的表达情况,分析其临床病理学意义。方法取93例原发性肝癌和10例正常肝组织,采用免疫组织化学（SP法）染色检测CD133和CD90表达。结果93例肝癌组织中,71例（76．3％）CD133表达阳性,阳性细胞百分数为（6．4±3．3）％,64例（68．8％）CD90表达阳性,阳性细胞百分数为（4.3＋3．9）％,10例正常肝组织中未见CD133和CD90阳性表达,差异有统计学意义（P〈0．01）;肝癌TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者CD133和CD90阳性细胞百分数[（8．1±3．7）％,（5．7±4．2）％]显著高于Ⅰ～Ⅱ期[（4．1±2．3）％,（2．3±1．9）％]（P〈0．01）;Spearman相关分析显示,随病理组织学分级级别增高,CD133和CD90的表达增多（P〈0．05）;CD133和CD90在肝癌组织中的表达呈正相关（r=0．402,P〈0．01）。结论肝癌组织中存在CD133和CD90阳性肝癌干细胞,其表达量与肝癌TNM分期和病理组织学分级呈正相关。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

人脐血CD34^＋细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的采用脐血CD34^＋细胞在rhGM—CSF、rhTNF—α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞。方法应用CD34^＋干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34^＋细胞,用rhGM—CSF、rhTNF—α联合诱导分化发育14d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达。结果50ml脐带血可分离出CD34^＋细胞约1．1×10^6,在rhGM—CSF、rhTNF-α诱导下CD34^＋干细胞培养2周,约扩增10～20倍。CD34^＋干细胞培养第3d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34^＋千细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81．7％。结论体外联合运用rhGM—CSF、rhTNF—α,能够成功诱导脐血CD34^＋细胞分化为大量成熟的DCs。