mcpr1基因的真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建腭裂相关基因mcpr1与pcDNA3 .1/V5 HisB融合的高效真核表达载体 ,为研究mcpr1基因的功能奠定基础。方法 :根据mcpr1基因的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过PCR方法 ,从包含有mcpr1基因全长的克隆载体T easy/mcpr1中 ,扩增出该基因外显子片段 ,将扩增产物连接到真核表达载体pcDNA3 .1/V5 HisB中。对该重组体进行PCR和酶切鉴定 ,以及测序验证。结果 :以重组体为模板扩增出40 0bp左右的特异性基因片段 ,与mcpr1基因片段大小一致 ,酶切鉴定也显示有 40 0bp左右的基因片断。测序结果显示与已知基因序列一致。结论 :成功构建mcpr1基因的真核表达载体 ,为下一步研究mcpr1基因的功能奠定了基础。     

ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。     

腭裂相关基因mcpr1在小鼠腭突发育及腭裂发生中的表达研究

目的检测mcpr1基因的蛋白在正常腭突及小鼠腭裂模型腭突发育中的时空表达模式。方法实验组管饲含全反式维甲酸的植物油诱导建立小鼠腭裂模型,对照组小鼠管饲植物油。2组取胎龄12、13、14、16 d的胎鼠各3只,包埋切片,HE染色观察2组胎鼠腭部发育的形态学变化,免疫组织化学方法观察MCPR1蛋白在2组胎鼠腭突中的表达差异。结果成功建立小鼠腭裂模型。切片HE染色观察发现实验组双侧腭突体积较对照组小,两侧腭突未接触;而对照组腭突融合,腭骨形成。免疫组织化学检查结果表明对照组小鼠胎龄12 d时MCPR1蛋白在腭突上皮细胞呈强阳性表达;而实验组小鼠胎龄12 d时腭突间充质细胞内MCPR1蛋白的表达较强,实验组胎龄16 d小鼠仅在上皮细胞附近的间充质细胞中有阳性表达。同一时间点比较,MCPR1蛋白的表达在实验组均强于对照组（P〈0.05）。结论 MCPR1蛋白的表达变化随腭部发育存在时空表达差异。     

新基因mcpr1在小鼠牙胚发育中的时空表达和意义

目的:探讨mcpr1在牙胚发生过程中的可能作用。方法:采用免疫组化LsAB法观察MCPR1在小鼠牙胚发育各个时期的表达分布及其变化情况。结果:MCPR1在小鼠牙胚各个时期均有表达,但各期分布模式有所不同,帽状期开始在成釉器上皮细胞表达,在釉结节内亦呈现强阳性表达,在分化成熟的成牙本质细胞及成釉细胞内呈现出强阳性表达。结论:mcpr1可能通过上皮-间充质之间的信号传递及相关基因的相互调控,参与成釉器的成熟及牙胚的发育。     

hOP-1成熟肽基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建hOP - 1成熟肽基因表达载体 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为研究OP - 1的功能作用以及制备OP - 1抗体奠定基础。方法 :构建hOP - 1/pEH4表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达OP- 1,SDS -PAGE对表达产物进行检测 ,凝胶薄层扫描判定蛋白表达量。结果 :pEH4/OP - 1重组表达载体转化DH5α,经温度诱导后 ,SDS -PAGE显示Mr约为 14× 10 3 的新蛋白条带。薄层扫描测定 ,表达蛋白占菌体总蛋白量的 33%。结论 :构建的hOP - 1/pEH4表达载体 ,在大肠杆菌DH5α中获得OP - 1成功表达     

鼠MyoD原核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的：对鼠肌肉转录调节因子MyoD基因扩增、鉴定，利用大肠杆菌表达其成熟肽。方法：MyoD cDNA基因原始质粒转化，提取质粒，酶切鉴定。然后将基因克隆人大肠杆菌非融合表达载体pBV220，受控于启动子PRPL，重组质粒pBV-my以大肠杆菌DH5α为宿主菌，在42℃进行温度诱导。结果：序列酶切鉴定完全正确；含重组质粒的工程菌经诱导后在SDS—PAGE上出现一条新生蛋白带，相对分子质量为55ku，与预期成熟肽相对分子质量大小一致，约占菌体总蛋白的30％。结论：成功地鉴定了MyoD cDNA序列，通过基因克隆构建了其原核表达载体pBV-my，并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

大鼠釉原蛋白基因表达的载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 观察釉原蛋白（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ,Ａｍ）基因聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）产物在大肠杆菌中的表达。方法 利用谷胱苷肽巯基转移酶表达载体４Ｔ－２型（ｐｔａｃ ｇｌｕｔａｈｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ,ＰＧＥＸ－４Ｔ－２）载化大肠杆菌ＤＨ５α,通过异丙基硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ,ＩＰＴＧ）诱导,收菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果 电泳分析表明,釉原蛋白基因ＰＣＲ产物在大肠杆菌中成功地获得了表达。结论 构建了ＰＧＥＸ－４Ｔ－２／Ａｍ融合表达载体,获得了融合表达的目的蛋白。     

人釉原蛋白基因在大肠杆菌中的融合表达

目的建立人釉原蛋白（AMG）成熟肽基因在大肠杆菌中融合表达和纯化的技术路线。方法利用已构建并经鉴定的重组质粒pGEX- 4T- 1/AMG转化大肠杆菌BL21,分别对诱导时间、异丙基- β- D硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导温度进行优化,在最佳诱导表达条件下,分别对菌液上清、周质、胞质和包涵体中的目的蛋白表达进行分析,在可溶性蛋白中发现大量目的蛋白,随后利用GSTrapFF亲和层析柱进行人AMG融合蛋白的过柱纯化。结果pGEX- 4T- 1/AMG重组质粒的双酶切凝胶电泳鉴定结果和测序鉴定结果和预期一致。最佳诱导时间为14.5 h、最佳诱导剂浓度为1.0 mmol/L、最佳诱导温度为20 ℃,在此条件下目的蛋白的表达量达到峰值。在最佳诱导条件下,胞质蛋白和包涵体中都有大量的目的蛋白。提取大量胞质蛋白,经GSTrapFF亲和层析柱纯化,收集纯化液,进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,显示成功纯化了AMG融合蛋白,在提取液洗涤2次后,可获得高纯度的融合蛋白。结论利用pGEX- 4T- 1/AMG原核表达体系成功获得纯化的人AMG融合蛋白。     

腭裂相关基因MCPR1在大肠杆菌中的融合表达及抗体制备

目的 :MCPR1是我室利用消减杂交技术克隆出来的新基因 ,本研究利用融合蛋白制备MCPR1的多克隆抗体。方法 :采用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出MCPR1基因蛋白编码序列 ,进一步将该基因片段克隆到中间载体pGEX -T -easy ,再酶切得到MCPR1片段定向克隆到 pGEX -4T -1载体中 ,构建融合表达载体pGEX -4T-MCPR1,在大肠杆菌中用IPTG进行诱导表达 ,得到GST -MCPR1融合蛋白 ,进行初步纯化及SDS -PAGE电泳 ,直接割胶 ,将其作为抗原免疫兔子。结果 :成功构建融合表达载体pGEX -4T -MCPR1,得到初步纯化的GST-MCPR1融合蛋白 ,免疫兔子 1个月后 ,获得免疫血清 ,初步纯化得到多克隆抗体。Western印迹分析表明所得到的抗体具有较强的特异性 ,ELISA分析证实其效价为 10 6。结论 :MCPR1多克隆抗体的获得性为在蛋白水平研究新MCPR1的功能提供了实验基础 ,后续实验可以利用免疫分析技术研究MCPR1蛋白与其它蛋白质的相互作用 ,从而为阐明MCPR1在胚胎发育及腭裂形成中所发挥的作用提供实验手段。     

Smad2基因MH2结构域表达载体的构建和其在大肠杆菌中的表达

目的：构建Ｓｍａｄ２基因ＭＨ２结构域原核融合表达载体,在大肠杆菌中表达ＭＨ２结构域,为制备抗ＭＨ２抗体,研究Ｓｍａｄ２基因和ＭＨ２结构域的功能奠定基础。方法：用ｐＧＥＸ－４Ｔ－２表达载体构建ｐＧＥＸ－４Ｔ－２／Ｓ２ＭＨ２原核融合表达载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＭＨ２融合蛋白,１００ｇ／ＬＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物。结果：重组载体转化ＤＨ５α,经ＩＰＴＧ诱导４ｈ后,在１００ｇ／ＬＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新的蛋白条带,相对分子质量（Ｍｒ）约为４９×１０３。结论：构建成功ｐＧＥＸ－４Ｔ－２／Ｓ２ＭＨ２融合表达载体,在大肠杆菌ＤＨ５α内表达获得ＧＳＴ－ＭＨ２融合蛋白。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因在大肠杆菌的融合表达

目的：克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,并使其在大肠杆菌中融合表达。方法：利用PCR方法克隆fimA,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果：克隆基因测序结果与GenBank数据库中的序列呈现99．9％同源性;经诱导表达后可观察到Mr38kDa的融合蛋白。结论：成功克隆了fimA基因,并在大肠杆菌中表达了FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。     

pEGFP—N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的：构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法：利用RT—PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T—Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP—N1真核表达载体连接,构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP—N1及pEGFP—N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT．PCR检测Snail在该细胞中表达。结果：本实验成功构建了pEGFP—N1—Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论：本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。     

多瘤病毒MT基因真核表达载体的构建

目的 :构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核细胞表达载体。方法 :从野生型多瘤病毒上取其nt46 32至nt15 6 0片段克隆到pUC19上 ,再将该片段定点插入 pEGFP1的HindⅢ和EcoRI位点间 ,构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核表达载体 pPyMT GFP。经线性化 ,将重组体导入鼠皮肤成纤维细胞中 ,G418选择培养 ,得到抗性细胞克隆。结果 :构建的pPyMT GFP质粒在鼠成纤维细胞中有稳定表达。 结论 :来源于野生型多瘤病毒的PyMT基因在哺乳动物细胞中有稳定表达 ,其真核表达载体 pPyMT GFP可被进一步用于研究PyMT蛋白在血管瘤发生中的作用     

构建用于酵母表达的hrCEMP1真核表达载体

目的：构建用于酵母表达的含hrCEMP1基因的真核表达载体。方法：采用PCR方法扩增hrCEMPI基因,利用定向克隆技术将hrCEMP1基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530中。重组的pWX530-hrCEMP1在大肠杆菌DH5ct中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定质粒构建是否成功。结果：酶切电泳鉴定和DNA序列测定证实重组质粒插入基因序列为hrCEMP1 cDNA。结论：成功构建含hrCEMP1基因的真核表达载体pWX530-hrCEMP1,该载体可直接转入酵母表达,为大批量获得CEMP1蛋白并进行牙周组织重建研究奠定基础。     

采用酵母表达载体pWX530构建表达人重组牙骨质蛋白1

目的：构建含人重组牙骨质蛋白1（recombination human cementum protein 1,rhCEMPl）基因的真核表达载体,观察其在酿酒酵母细胞中的表达。方法：采用PCR方法扩增rhCEMPl基因,利用定向克隆技术将rhCEMPl基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530。重组的pWX530-rhCEMPl在大肠杆菌DH5a中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定所构建的质粒。经鉴定正确的表达载体pWX530-rhCEMPl转入酵母感受态细胞中,酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析蛋白表达情况,离子交换层析提纯蛋白。结果：构建的重组质粒成功转入酵母细胞,通过SDS—PAGE和ELISA检测rhCEMPl表达成功。结论：成功构建的含m—CEMPl基因的真核表达载体pWX530-rhCEMPl,并能转入酵母细胞中成功表达。     

少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因突变分析及其真核表达载体的构建

目的克隆少汗型外胚层发育不良症（HED）eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列突变型（M）和野生型（W）的真核表达载体pcDNA3.1（-）-eda-A1-M/W,为进一步明析eda基因的功能奠定基础。方法设计含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的引物, 从HED患者和正常人外周血淋巴细胞中提取总mRNA,利用RTPCR法克隆eda-A1（M/W）基因cDNA序列;并运用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1（-）载体和eda-A1基因片段,将eda-A1 （M/W） 插入到pcDNA3.1 （-） 载体中,从而构建新的真核表达载体,命名为pcDNA3.1 （-）-eda-A1-M和pcDNA3.1（-）-eda-A1-W。结果成功克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因,并发现未见报道过的907位A→C错义突变,导致306位编码氨基酸由谷氨酰胺变异为脯氨酸;经PCR法、重组载体双酶切法、DNA测序验证,成功构建了pcDNA3.1（-）-eda-A1-W/M的真核表达载体。结论成功构建少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因（突变型和野生型）真核表达载体pcDNA3.1（-）-eda-A1-M/W,为进一步研究该基因在牙齿发育中的生物学作用奠定了实验基础。