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1.
为研究表达反义c-mycRxA的逆转录病毒载体抑制靶基因的表达和翻译,使胰腺癌细胞恶性表型逆转的机理,利用PXTI逆转录病毒载体构建了一个能表达反义c-mycRNA的质粒,经病毒包装细胞PA317包装后,使之成为具有感染力的重组病毒。用该病毒感染人胰腺癌细胞系PC-2细胞,经G418筛选得到稳定的转化细胞系。Northernblot杂交证实包装细胞PA317及转化的PC-2细胞中均有病毒的高表达,体外合成的单链RNA探针杂交结果表明转化PC-2细胞中有高表达的反义c-mycRNA,而内源性c-mycRNA的表达明显受抑;Westernblot分析发现c-myc癌基因产物P62蛋白的表达显著下降。反义c-mycRNA使人胰腺癌细胞生长速率、~3H-胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及探鼠致瘤能力等均明显下降。实验结果表明:表达反义c-mycRNA的逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达和翻译,使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。 相似文献
2.
目的研究癌基因的特异性反义RNA对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒(HPV)-16E6E7反义RNA导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中,观察该细胞在导入反义RNA后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果HPV-16E6E7反义RNA能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率,抑制其在软琼脂上的集落形成能力,并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力。Westernblot分析发现HPV-16E6E7反义RNA能使宫颈癌细胞中病毒HPV-16E6基因的表达水平降低。结论HPV-16E6E7反义RNA能使宫颈癌细胞CaSki恶性表型逆转;由其引起的癌细胞中HPV-16癌基因表达水平的降低可能是癌细胞表型逆转的原因之所在;HPV-16癌基因的表达水平对维持癌细胞的恶性表型起着重要作用。 相似文献
3.
用重组逆转录病毒载体构建能表达反义Ki-ras癌基因RNA的重组体,经磷酸钙沉淀法导入病毒包装细胞PA317中。RNA杂交分析表明,转化包装细胞系中有重组病毒载体的表达。利用转化包装细胞分泌的病毒上清液感染人胰腺癌细胞系PC-2细胞,经Puromycin筛选得到稳定的转化细胞系。RNA杂交证实转化的胰腺癌细胞中有病毒高度表达,靶基因表达明显减弱。反义Ki-rasRNA使人胰腺癌细胞生长速率下降约65%。 ̄3H胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及裸鼠致瘤能力等均显著下降。这一结果表明,反义Ki-ras逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达,使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。 相似文献
4.
目的:观察蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞生长、细胞周期和cyclinE表达的影响。方法:脂质体法转染反义PKCα,MTT法测细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及点印迹法检测cyclinE表达。结果:①随着反义PKCα的浓度增加,细胞生长指数逐渐降低(P<0.01)。②反义PKCα使细胞G1期百分比增高(P<0.05)。③反义PKCα使细胞cyclinE的表达减弱,扫描定量反义PKCα组为对照组的66.5%±18.4%(P<0.05)。结论:反义PKCα可通过抑制cyclinE表达、阻滞细胞于G1期从而抑制CNE-2Z的生长。 相似文献
5.
Bmi-1 基因过表达对人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1增殖的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
目的: 探讨原癌基因B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区1( Bmi-1 )过表达对人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1增殖的影响。方法: 采用逆转录病毒介导转染方法将携带原癌基因 Bmi-1 的质粒或空质粒稳定转染GES-1细胞,通过real-time PCR及Western blotting在mRNA及蛋白水平鉴定转染效果。流式细胞术检测过表达 Bmi-1 对GES-1细胞周期的影响。应用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测稳定转染 Bmi-1 对GES-1细胞增殖的影响。结果: Real-time PCR及Western blotting结果均表明成功建立稳定转染 Bmi-1 基因的GES-1细胞株。流式细胞术结果表明,过表达 Bmi-1 基因使GES-1细胞G0/G1期减少,G2/M期和S期细胞增多。生长曲线显示,过表达 Bmi-1 基因使GES-1细胞增殖速度明显提高。结论: 过表达 Bmi-1 基因能调控GES-1细胞的细胞周期,促进GES-1细胞的增殖。 相似文献
6.
目的: 研究利用RNA干扰技术,以黏附斑激酶(FAK)为靶基因,构建FAK-shRNA重组逆转录病毒载体,将其导入包装细胞Phoenix中,筛选出稳定产生FAK-shRNA病毒的细胞克隆,以病毒上清感染并筛选FAK表达沉默的细胞株,观察其对相关蛋白表达的影响。方法: 体外合成能转录产生靶向FAK短发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体,以脂质体法转染Phoenix细胞株,待筛选稳定克隆成功后收获病毒上清,感染人肝癌细胞株HCC-LM3,以嘌呤霉素筛选得到抑制FAK表达的稳定细胞株后用Western boltting鉴定FAK表达的抑制效果及相关蛋白表达情况。结果: 构建了重组逆转录病毒载体pSuper-FAK并抑制了人肝癌HCC-LM3细胞内FAK蛋白的表达。在下调FAK表达的细胞株中p-Akt和p-MAPK1/2表达明显受到抑制。下调FAK的细胞株迁移和侵袭能力下降,细胞周期多被阻止在G0/G1期,细胞凋亡增多,增殖率明显下降。结论: 重组逆转录病毒载体pSuper-FAK转染包装细胞Phoenix后,其产生的FAK-shRNA病毒可以抑制HCC-LM3细胞内的FAK蛋白表达并抑制Akt及MAPK1/2磷酸化。下调FAK后可以对肿瘤细胞的生物学行为产生明显影响。 相似文献
7.
CT120反义寡核苷酸抑制肺腺癌细胞A549的生长 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨CT120基因与肺腺癌细胞A549生长、分化的关系。方法 构建含有CT120基因的反义表达载体(命名为pcDNA3.1-CT120),并将该载体转染肺腺癌细胞A549,应用G418筛选,获得了稳定表达CT120反义基因的克隆(命名为pcDNA3.1-CT120-A549)。RT-PCR和Western blot 检测CT120表达。流式细胞仪和软琼脂集落形成实验分析细胞生长,同时用RT-PCR检测P53、CYCLIND1 和CDK4的表达。结果 成功构建了含有CT120基因的反义表达载体,而且该载体能够有效抑制CT120在肺腺癌细胞A549中的表达。抑制CT120基因的表达能够抑制细胞的生长,促进细胞凋亡。在稳定表达CT120反义基因的克隆中P53表达明显上调,CYCLIND1 和CDK4表达明显下调。结论 反义寡核苷酸抑制CT120的表达有可能是肺癌基因治疗的一个新的靶点。 相似文献
8.
人Gax基因转染对血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
目的: 探讨腺病毒介导人生长终止特异性同源异型盒基因(hGax基因)转染对血清刺激后兔血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和细胞周期的影响,为静脉桥再狭窄基因治疗新策略提供帮助。方法: 构建含 hGax 的重组腺病毒载体并感染兔VSMCs;应用RT-PCR、免疫荧光染色检测hGax mRNA和蛋白的表达; MTT法观察hGax基因过表达对血清刺激后VSMCs增殖的影响;划痕法测定细胞迁移;流式分析细胞周期。结果: 成功构建Ad5-hGax重组腺病毒载体。转染48 h后 RT-PCR和免疫荧光染色法示转染 hGax 基因的VSMCs中存在目的基因特异性片段(174 bp)和目的蛋白表达;MTT法示hGax蛋白显著抑制血清刺激后VSMCs增殖;划痕法示hGax基因过表达明显抑制血清刺激后VSMCs迁移;流式结果示血清刺激72 h后,Ad5-hGax转染组G0/G1期细胞比例明显增加,G2/M+S期细胞减少。结论: 含hGax的重组腺病毒载体构建成功,并在细胞中过表达。hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖和迁移,并使细胞停滞于G0/G1期。 相似文献
9.
人乳头瘤病毒16型E6E7反义RNA抑制宫颈癌细胞恶性?… 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 研究癌基因的特异性反义RNA对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法 用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒(HPV)-6E6E7反义RNA导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中,观察该细胞在导入反义RNA后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果 HPV-16 E6E7反义RNA能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率,抑制其在软琼脂上的集落形成能力,并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力 相似文献
10.
目的: 获得人早期生长反应1(EGR1)基因,并在人骨肉瘤细胞中瞬时表达,研究该基因在人骨肉瘤细胞中的作用,并探讨其可能的作用机制。方法: 以人胎盘组织为模板,巢式PCR(nest PCR)扩增获得EGR1全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),酶切、PCR鉴定并测序正确后,命名为pcDNA-EGR1。脂质体法将重组载体转染人骨肉瘤细胞U2OS,实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫印迹检测目的基因的表达; MTT法检测细胞生长和增殖情况;流式细胞仪和DAPI染色检测细胞的周期变化和凋亡情况;qPCR检测细胞中与细胞周期、凋亡相关基因的表达变化情况;短发夹RNA(shRNA)干扰EGR1后,检测细胞的变化情况。结果: 成功获得了人EGR1基因并构建了其重组表达载体pcDNA-EGR1。EGR1可有效地在U2OS中瞬时表达;可显著抑制细胞增殖(P<0.05),并呈一定的剂量依赖。EGR1可引起细胞周期停滞于G0/G1期,并促进凋亡率增加(P<0.05)。EGR1可引起细胞核出现明显的固缩和凋亡表型。EGR1可引起周期相关基因表达下调,凋亡相关基因表达则显著上调。shRNA干扰EGR1后,细胞凋亡表型和EGR1所调控的相关基因表达水平与对照组一致。结论: EGR1具有抑制骨肉瘤细胞增殖作用,能调节骨肉瘤细胞周期和凋亡相关基因的表达,从而促进细胞周期停滞和凋亡率的增加。 相似文献
11.
T638和L6565模型是目前国内仅有的两株RNA病毒诱发的白血病 ,均属于我国天津 (T) -上海 (S) -遵义 (Z)小鼠白血病系统之内[1 ,2 ] 。近年来未见T638白血病研究的进一步报道 ,情况不详。L6565病毒性淋巴细胞白血病是由程立等于 1 965年建立的瘤株[3~ 6] 。 1 986年张雷等[7] 应用L6565白血病小鼠外周血液无细胞提取液感染NIH/3T3细胞 ,在体外建成了L6565-B1 细胞系 ,惜已失传。最近 ,殷莲华等[8] 将L6565白血病小鼠脾脏在灭菌条件下制成细胞悬液后 ,用RPMI 1 640液和 1 0 %小牛血清中培养 2 0代后 ,再用有限稀释法置… 相似文献
12.
目的: 研究反义c-myc寡核苷酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法: 设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞,通过MTT法、流式细胞仪、HE染色及透射电镜方法,观察和分析其对人骨肉瘤MG-63细胞作用的效果。结果: MTT法示反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖,10.0 μmol/L、作用48 h效果最明显;流式细胞仪检测证实反义c-myc寡核苷酸(终浓度10.0 μmol/L)诱导瘤细胞的凋亡率达37.92%,出现明显的凋亡峰,并可抑制c-myc基因蛋白的表达;细胞呈典型凋亡特征。结论: 反义c-myc寡核苷酸能有效诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。 相似文献
13.
《中华病理学杂志》2009,38(12)
目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的. 相似文献
14.
目的:构建反义VEGF基因真核表达载体,研究其对肾癌细胞VEGF表达的影响。 方法: 克隆人VEGF基因,将反义VEGF基因定向克隆于质粒pcDNA3.1(-)真核表达载体,酶切鉴定;转染人肾癌细胞,G418筛选阳性克隆。RT-PCR方法检测VEGFmRNA的表达,免疫组化法检测VEGF基因的蛋白表达,MTT法测细胞生长,流式细胞术检测细胞周期。 结果: 成功构建反义VEGF基因真核表达载体;反义 VEGF组VEGFmRNA的表达受到抑制,明显低于空载体组和对照组VEGFmRNA的表达,空载体组VEGFmRNA的表达没有受到影响;反义 VEGF组的VEGF蛋白表达明显低于空载体组和对照组,空载体组和对照组VEGF蛋白的表达无显著差异;反义 VEGF组细胞生长减慢,G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。 结论: 人反义VEGF基因可明显降低肾癌细胞VEGF基因在转录和翻译水平的表达,抑制肾癌细胞生长,为肾癌基因治疗提供一定的实验依据。 相似文献
15.
《International journal of immunopharmacology》1993,15(5):567-572
The occurence of aberrant, retrovirus-related proteins is a common finding in immunogenic clones of the triazene-xenogenized L5178Y lymphoma line (L5178Y/DTIC). In clone D-cells, newly expressed 80 kDa antigens related to xenotropic murine leukemia virus env gene products induce specific humoral and cell-mediated responses and possess biologic activity in vivo. To further clarify the relationship between immunogenic properties of clone D and retroviral gene expression, tumor cells were treated in vitro with antisense oligonucleotides complementary to xenotropic and/or polytropic env sequences of murine leukemia virus. The cells were then assayed for expression of antigens recognized by humoral and cell-mediated responses with specificity for clone D. The results demonstrated that inhibition of env mRNA translation adversely affected the expression of immunogenic determinants in the xenogenized tumor cells. 相似文献
16.
Yen Chong S Lin YC Czarneski J Zhang M Coffman F Kashanchi F Raveche E 《Genes and immunity》2001,2(5):239-247
IL-10 is overexpressed in human chronic lymphocytic leukemia (CLL), and is an autocrine growth factor involved in the development of malignant B1 clones in NZB mice, a murine model for CLL. Antisense IL-10 oligonucleotide treatment induces apoptosis and cell cycle disruption in these cells both in vitro and in vivo. In addition, NZB IL-10 knock-out mice fail to develop the B-1 clones. Dampening of IL-10 protein production via antisense IL-10 oligonucleotide treatment is correlated with decreased p27/Kip1 protein expression which results in increased cyclin D2, cyclin E and cyclin A associated kinase activity. The action of the antisense oligonucleotides is through alterations in cell cycle regulation, resulting in accelerated cell cycle progression, a G2/M block which culminates in apoptosis induction in the malignant cells. This implies that the role of IL-10 as an autocrine growth factor in malignant B-1 cells lies in its ability to inhibit apoptosis induction through the maintenance of sustainable cell cycle progression in malignant cells. 相似文献
17.
用反义寡核苷酸阻断热休克蛋白70表达诱导卵巢癌细胞凋亡 总被引:14,自引:0,他引:14
目的 观察特异性热体克蛋白70(heat-shock protein,HSP)反义寡核苷酸阻断卵巢癌细胞的HSP70表达,及其对卵巢癌细胞生长和增殖的影响。方法 用胎盘蓝拒染法计算卵巢癌细胞的生长抑制率。Giensa染色法从形态上了解凋亡的发生,用琼脂糖凝胶电脉进一步检测发生凋亡的特征性DNA降解,流式细胞仪定量分析凋亡发生率及周期性异性。结果 用HSP70反义寡核苷酸处理的卵巢细胞表现有显的生长 相似文献
18.
目的:观察反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法:构建反义和正义c-myc真核表达载体pcDNA3-myc-antisense和pcDNA3-myc-sense,利用lipofectin将正义及反义c-myc真核表达载体导入大鼠气道平滑肌细胞,MTT法观察正义和反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用,流式细胞技术检测细胞周期变化,免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达。结果:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,延长细胞S期,反义c-myc真核表达载体可降低气道平滑肌细胞c-Myc蛋白的表达。结论:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖。 相似文献
19.
Epstein-barr virus can infect B-chronic lymphocytic leukemia cells but it does not orchestrate the cell cycle regulatory proteins 总被引:1,自引:0,他引:1
Maeda A Bandobashi K Nagy N Teramoto N Gogolák P Pokrovskaja K Székely L Björkholm M Klein G Klein E 《Journal of human virology》2001,4(5):227-237
OBJECTIVES: To understand the mechanism for the refractoriness of B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells for Epstein-Barr virus (EBV)-induced immortalization. STUDY DESIGN/METHODS: Cultures were initiated with EBV-infected tonsillar B and B-CLL cells. Expression of EBNA-2 and some of the key players regulating G1/S phase transition such as c-myc expression, phosphorylation of Rb protein, expression of G1 cyclins, and the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 were followed. RESULTS: In line with earlier studies, EBV infection induced c-myc expression, pRb phosphorylation, D2 and D3 expression, and disappearance of p27 in normal B cells. In contrast, EBV-infected B-CLL cells remained resting and they did not express c-myc; cyclin D2, ppRb and cyclin D3 were seen only in occasional cells. Importantly, p27 expression was maintained. CONCLUSIONS: In B-CLL cells, the expression of the EBV-encoded nuclear proteins EBNAs is not followed by entrance to the cell cycle. Thus, the difference in the interaction of EBV-normal B cells and EBV-B-CLL cells is already apparent early after infection. 相似文献