反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响

目的研究反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响,探讨其对肿瘤发展和转移的影响.方法以端粒酶逆转录酶组分hTERT cDNA为模板构建反义hTERT逆转录病毒表达载体,包装重组逆转录病毒后感染胃癌SGC7901细胞,用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGF-C及其受体Flt-4 mRNA表达水平的变化,免疫组化法检测VEGF-C、Flt-4蛋白表达.结果反义hTERT稳定转染后SGC7901细胞VEGF-C及其受体VEGFR-3（Flt-4） mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.结论反义hTERT可有效抑制胃癌细胞VEGF-C及其受体Flt-4的表达,阻断肿瘤血管和淋巴途径转移.     

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响

为了探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞 (hEFs)端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响 ,采用基因重组技术构建hTERT全长cDNA正义荧光真核表达载体 ,并采用脂质体法将正义重组质粒pIRES2 EGFP hTERT及空载质粒pIRES2 EGFP分别转染原代培养hEFs,检测转染细胞端粒长度、端粒酶活性及端粒酶亚单位的变化。结果显示 ,外源性hTERT基因转染细胞 (hEF hTERT)端粒酶活性较未转染细胞 (hEFs)及空载体转染细胞 (hEF EGFP)显著增加 (P <0 0 1) ,hEF hTERT、hEFs及hEF EGFP端粒长度分别为 6 0kb、5 3kb及 5 4kb ,端粒酶亚单位中除hTERT在mRNA和蛋白水平表达均增加外 ,hTR和TP1mRNA无明显变化。以上结果提示 ,外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEFs端粒酶活化 ,端粒长度不再继续缩短 ,hTERT在mR NA和蛋白水平表达增加     

A549肿瘤细胞中特异性hTERT-siRNA的干扰作用研究

目的 研究hTERT特异的siRNA对肿瘤细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。方法 设计和构建由U6启动子驱动的产生特异hTERT的siRNA表达质粒,转染至A549肺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,Western blot检测端粒酶蛋白的表达,MTT法检测对细胞生长的影响。结果 构建的针对hTERT基因745靶位点的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的A549肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论 应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向。     

抑制端粒酶活性对1,25-（OH）2D3诱导肝癌细胞增殖分化的影响

目的：观察抑制端粒酶活性对1,25-（OH）2D3诱导肝癌细胞增殖分化的影响作用。方法：经脂质体介导,将反义端粒酶RNA转染肝癌细胞系SMMC7721细胞。转染细胞扩大培养后,添加1,25-（OH）2D3分别作用于各实验组细胞后,采用MTT法、平板克隆形成实验检测细胞的存活和生长;光镜和电子显微镜检测细胞分化形态改变。结果：对照组与转染组的吸光度值分别为1.685和0.686,说明转染反义端粒酶RNA可显著抑制肝癌细胞的端粒酶活性;而在抑制肝癌细胞端粒酶活性的基础上,1,25-（OH）2D3抑制肝癌细胞增殖和诱导细胞分化的作用得以显著的增强。形态学检查也进一步证实存在诱导分化改变。结论：在降低细胞端粒酶活性的基础上,1,25-（OH）2D3抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞分化的作用得到增强。     

乳腺肿瘤端粒酶活性及hTERT mRNA检测的临床意义

目的：探讨乳腺肿瘤端粒酶活性及hTERT mRNA检测的临床意义。方法：采用ELISA-TRAP法检测了48例乳腺癌、36例乳腺增生及30例乳腺纤维腺瘤组织端粒酶活性；同时采用RT-PCR检测其hTERT mRNA表达。所有样本行常规病理学检查。结果：乳腺癌、乳腺增生及乳腺纤维腺瘤组织端粒酶活性阳性率分别为89．6％(43／48)、33．3％(12／36)及26．7％(8／30)。hTERT mRNA表达阳性率分别为91．7％(44／48)、36．1%(13／36)及26．7％(8／30)。结论：端粒酶的激活与乳腺癌的发生密切相关，端粒酶活性及hTERT mRNA表达水平的检测有助于乳腺癌的诊断及鉴别诊断。     

反义端粒酶RNA抑制胶质瘤细胞系BT—325细胞端粒酶活性表达

目的：观察反义端粒酶RNA对BT－325细胞的作用,探讨粒酶在恶性胶质瘤发生过程中的可能作用及反义端粒酶RNA在恶性胶质瘤基因治疗中的意义。方法：经脂质体介导的方法将pBBS 212-hTR(反义端粒酶RNA真核表达载体）导入BT－325细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用TRAP－PAGE电泳,电镜和TUNEL技术检测BT－325／pBBS 212-hTR的细胞的端粒活性表达,细胞凋亡的情况。结果：与对照组比较,反义端粒酶RNA显著抑制BT－325细胞端粒酶活性,诱发细胞发生凋亡。结论：转染反义端粒酶RNA在封闭细胞粒酶活性表达的同时,可促进BT－325细胞凋亡,在研究恶性胶质瘤发病机制及治疗方面做了有益的探讨。     

RNA干扰抑制端粒酶对受照后端粒长度的影响

目的 探索RNA干扰体内表达质粒抑制端粒酶表达的作用,以及端粒酶抑制后射线对端粒长度的影响.方法 构建RNA干扰体内表达质粒,脂质体介导转染A549细胞系,TRAPELISA法检测端粒酶活性,RT-PCR法检测hTERTmRNA表达,端粒限制性片段平均长度分析法检测端粒长度.结果 pPUR/hTERT质粒在A549转染株内表达可下调hTERT mRNA表达,抑制端粒酶活性;A549照射后端粒明显延长,而pPUR/hTERT表达株照射后未见端粒延长,抑制了射线诱导端粒延长作用.结论 RNA干扰体内表达质粒可抑制端粒酶表达及照射后端粒延长,表明射线诱导端粒延长可能是端粒酶在端粒断裂端合成端粒序列的结果.     

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC27901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的：探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系，了解Hp的致癌机制。方法：在Hp培养滤液诱导前后，采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达。结果：对照组SGC7901胃癌细胞24h、36h和48h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组（P〈0．05）。在Hp滤液诱导下，抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24h、36h和48h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异（P〉0．05）。结论：Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达，这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一。端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达。     

反义核酸治疗恶性肿瘤的可能性

反义核核酸略被广泛用于研究白细胞的基因财控，证实多种基因与肿瘤的发生及增殖相关。某些癌基因的反义寡核苷酸能有效地抑制白血病细胞的增殖和肿瘤生长，基础及临床研究结果表明，反义寡核有可能成为恶性肿瘤基因治疗的一类新药。     

端粒酶与肿瘤

端粒 (ｔｅｌｏｍｅｒｅ)是存在于真核生物线性染色体末端 ,由串联重复的ＤＮＡ序列及其相关蛋白质组成的结构。其长度和细胞寿命的控制相关。端粒酶 (ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ)为核酸蛋白质复合物 ,是一种能将端粒ＤＮＡ加以延伸的酶。在绝大多数真核生物的细胞中 ,端粒的长度都是通过端粒酶维持的。凡是端粒酶活性强的细胞其端粒的长度能维持一定平衡 ,因无端粒缩短的限制而使细胞具有永生性。反之测不到端粒酶活性的细胞多数于端粒长度递减到一定程度即不能再进入分裂周期 ,停止繁殖并趋向病态随之死亡。由于肿瘤细胞是无限增殖的细胞 ,不会…     

HP培养滤液诱导下抑制bcl-2基因表达对SGC7901细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨bcl-2表达与hTERT、端粒酶活性之间的调控关系,了解HP的致癌机制。方法:在HP培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测bcl-2AODN抑制bcl-2基因之后人SGC7901细胞hTERT蛋白的表达。结果:对照组人SGC7901细胞24h、36h和48h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于经HP培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05)。在HP滤液诱导下,抑制bcl-2基因的SGC7901胃癌细胞24h、36h和48h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于与SGC7901胃癌细胞(P<0.05),同时显著高于对照组(P<0.05)。结论:bcl-2基因正向调控hTERT蛋白表达,bcl-2表达上调可能是端粒酶活化的主要途径之一。端粒酶的激活不完全依赖于bcl-2途径,还存在其他的调控因素。HP感染不仅通过上调bcl-2的表达,还可以通过其他途径激活端粒酶,这可能是HP感染致癌的一条重要途径。     

^99Tc^m—hTERT mRNA反义分子探针荷MCF-7乳腺癌裸鼠显像

目的制备^99Tc^m-人端粒酶催化亚单位（hTERT）mRNA反义寡核苷酸（ASON）显像分子探针并验证其在荷MCF-7乳腺癌裸鼠早期诊断中的价值。方法采用双功能螯合剂法制备^99Tc^m-hTERT mRNA无义寡核苷酸（SON）、ASON探针。建立荷MCF-7乳腺癌裸鼠模型,运用阳离子脂质体介导法进行活体显像。采用SPSS12．0软件进行单因素方差分析。结果^99Tc^m-hTERT mRNA ASON标记率达到（76±5）％,放化纯〉96％,比活度达到1850kBq／μg。室温放置和健康人血清孵育24h后的放化纯均〉93％。SON与ASON的标记率基本一致。注射后4h反义组荷瘤裸鼠右上肢接种肿瘤部位可见放射性摄取,6～8h后显影清晰;无义组始终未见肿瘤部位放射性浓聚。反义组有和无脂质体介导的肿瘤／非肿瘤组织放射性（T／NT）比值分别为8．02±0．03和7．55±0．12,差异无统计学意义（t=-1．99,P〉0．05）;无义组有和无脂质体介导的T／NT比值分别为1．23±0．06和1．33±0．15,差异无统计学意义（t=0．42,P〉0．05）。但是分别比较反义组与无义组、脂质体介导组与无介导组间差异均有统计学意义（t=26．30和28．71,P均〈0．001）。结论^99Tc^m-hTERT mRNA ASON在荷瘤裸鼠活体内可与高表达hTERT基因的人乳腺癌MCF－7肿瘤组织特异靶向结合,在肿瘤分子功能显像中具有潜在应用价值。     

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC7901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系,了解Hp的致癌机制。方法:在Hp培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达。结果:对照组SGC7901胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05)。在Hp滤液诱导下,抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异(P>0.05)。结论:Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达,这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一。端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达。     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.