山莨菪碱对低密度脂蛋白受体再循环的影响

目的：观察山莨菪碱对低密度脂蛋白受体再循环的影响。     

LDL-ACM复合物对胃癌细胞株(SGC-7901,NKM-45)的细胞毒作用

以低密度脂蛋白（LDL）作为脂溶性抗癌瘤药物阿克拉霉素（ACM）的载体，用四甲基偶氮唑蓝比色分析（MTT）、3H－TdR掺入及细胞蛋白质合成法研究了LDL－ACM复合物和游离ACM对胃癌细胞株（SGC－7901，NKM－45）以及正常人胃成纤维细胞的细胞毒作用。结果显示，LDL－ACM复合物对癌瘤细胞的杀伤作用明显强于游离ACM，对SGC－7901的杀伤作用尤其显著；而该复合物和游离ACM对胃成纤维细胞的作用无明显差异；LDL－ACM复合物对癌瘤细胞DNA及蛋白质合成的抑制作用显著大于游离ACM。提示LDL受体介导的药物细胞毒作用强于单独使用游离ACM，用LDL作为药物载体进行癌瘤导向治疗具有广阔发展前景。     

糖基化低密度脂蛋白受体途径代谢与动脉粥样硬化关系的实验研究

本文旨在观察低密度脂蛋白(LDL)糖基化对其受体途径代谢的影响。以密度梯度超速离心法分离人血清LDL,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度后用一氯化碘法将其标记成~(125)I-LDL。在培养的人成纤维细胞上进行LDL放射受体分析并检测细胞内总胆固醇含量。该受体最大高亲和性结合(Bmax)为47ngLDL/mg细胞蛋白,亲和常数(Km)为9.4μg/ml。糖基化LDL的受体结合、摄入和降解值显著低于对照LDL(P<0.01),而糖基化LDL孵育的细胞,其总胆固醇含量却明显增高(P>0.01)。结果提示,LDL糖基化可能是糖尿病人易患脂代谢障碍和动脉粥样硬化的重要机制。     

以放射配基法比较四种培养细胞LDL受体活性

低密度脂蛋白(LDL)受体在脂代谢调控及动脉粥样硬化中起关键作用。笔者建立的放射配基测定法实用、可靠、精密度高,以此比较了人胚肺成纤维细胞,人胚皮肤成纤维细胞,恒河猴胚肾上皮细胞和猴内皮细胞的 LDL 受体活性,可作为研究 LDL受体活性及影响因素的重要手段。     

肝细胞生长因子对培养大鼠系膜细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对培养大鼠肾小球系膜细胞转录及表达低密度脂蛋白(LDL)受体的影响.方法:以10、20、50、100 ng/ml HGF与大鼠系膜细胞在高LDL环境(250 μg/ml)中共孵育,应用RT-PCR及酶联免疫吸附方法,观察大鼠系膜细胞LDL受体的转录与表达的变化.结果:HGF可时间依赖及浓度依赖地在转录水平与蛋白水平增加培养大鼠系膜细胞LDL受体表达,并且不被高LDL环境所抑制.结论:HGF通过促进系膜细胞表达LDL受体,增加系膜细胞对LDL的摄取,可能参与了脂质肾损伤过程.     

骨髓成纤维细胞无血清培养体系的建立及R蛋白对其生长的影响

R蛋白是一种存在于巨噬细胞膜上的受体蛋白，在调节吞噬作用过程中起着重要作用。除巨噬细胞外，骨髓基质细胞也可分泌R蛋白。本文建立了小鼠骨髓成纤维细胞无血清培养体系，并调查了无血清培养条件下R蛋白对小鼠成纤维祖细胞生长的影响。结果发现：多聚赖氨酸能增强成纤维细胞贴壁能力；成纤维细胞生长在无血清培养体系及含血清培养体系中无显著差异（P＞0．05）；R蛋白对成纤维细胞生长有一定的促进作用（P＜0．05）。     

低密度脂蛋白受体基因AVa Ⅱ多态性与动脉粥样硬化性脑梗死关系研究

目的：探讨低密度脂蛋白受体（LDL－R）基因AVa Ⅱ多态性与动脉粥样硬化性脑梗死（ACI）的关系。方法：用聚合酶链反应（PCR）技术检测113例沈阳籍汉族健康人和56例ACI病人的LDL－R基因AVa Ⅱ多态性及血脂、脂蛋白的含量。结果：LDL－R基因AVa Ⅱ A^ 等位基因频率健康人为0．230，ACI病人为0．125；A^-基因与ACI的相对风险率（RR）为2．1（P＜0．05）。ACI组中的A^-A^-亚组病人血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、脂蛋白（a)[LP(a)]明显高于对照组；载脂蛋白（apo) A I则低于对照组（P＜0．05）。／A^-A^-基因型与血清TG、TC、LDL－C、LP（a)升高显著相关联，RR依次为3．39、6．08、6．01、5．78（P均＜0．01）。结论：LDL－R基因多态性影响血脂、脂蛋白的代谢，与ACI的发生发展密切相关；A^-基因可能是ACI发生的遗传易患因素之一。     

家族性高胆固醇血症纯合子患者低密度脂蛋白受体缺陷的研究

目的：研究家族性高胆固醇血症纯合子患者的发病机理。方法：在临床研究和家系调查的基础上，培养患者皮肤成纤维细胞，采用放射性配体结构受体分析技术研究其低密度脂蛋白受体。结果：患者低密度脂蛋白受体对低密度脂蛋白的高亲和性结合为正常人的78．2％，高亲和性内移和降解则分别为正常人的3．6％和1．7％。结论：本例家族性高胆固醇血症纯合子患者的发病机制为低密度脂蛋白受体内移功能障碍。     

高密度脂蛋白和低密度脂蛋白对HepG2细胞SR-BI表达的影响

目的观察高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对HepG2细胞B类I型清道夫受体(SR-BI)表达及胆固醇含量的影响。方法用HDL、LDL及ox-LDL处理HepG2细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测细胞SR-BI的表达;采用油红O染色及高效液相色谱法(HPLC)观察细胞内脂质的含量。结果HDL、LDL及ox-LDL处理HepG2细胞后,与对照组比较,各脂蛋白处理组细胞SR-BI mRNA及蛋白表达上调,油红O染色发现HDL、LDL及ox-LDL处理组细胞内脂滴含量明显增加;HPLC检测提示,与对照组细胞内总胆固醇含量(43.18±7.80 mg/g蛋白)比较,ox-LDL处理组(113.01±15.90 mg/g蛋白)、LDL处理组(171.13±20.01 mg/g蛋白)及HDL处理组(220.39±28.00 mg/g蛋白)细胞内总胆固醇含量增加,其中HDL处理组变化最明显。结论HDL、LDL及ox-LDL三种脂蛋白可上调HepG2细胞SR-BI的表达,增加细胞内胆固醇的蓄积。     

家兔HDL的纯化和鉴定及其功能的初步研究

流行病学调查及动物实验结果均表明,高密度脂蛋白(HDL)具有抗动脉粥样硬化作用。作者为进一步了解HDL在细胞水平上的作用,建立了用密度梯度区带超速离心直接从新鲜家兔血清中分离纯化HDL的方法;将HDL加入正常及高脂血兔血清,观察低密度脂蛋白(LDL)通过平滑肌细胞(SMC)LDL受体的cpm,并分别与各自未加HDL组比较,以了解HDL在正常及高脂情况下对LDL受体的作用.     

凝血酶影响血管内皮细胞通透性的实验研究

目的 :评价凝血酶对血管内皮细胞通透性的影响及其机制。方法 :在体外培养血管内皮单细胞层 ,并测定凝血酶引起的血管内皮单细胞层电阻变化。结果 :凝血酶能够迅速降低血管内皮单细胞层的电阻 ;而肌球蛋白轻链激酶抑制剂 ML- 7能够抑制凝血酶引起的血管内皮单细胞层电阻变化。结论 :凝血酶可以升高血管内皮细胞肌球蛋白轻链的磷酸化水平 ,从而导致血管内皮细胞通透性增高。     

接触抑制对转化生长因子β诱导基因22（TSC-22）在心脏成纤维细胞中表达的影响

目的通过建立体外原代培养的新生大鼠心脏成纤维细胞模型,研究接触抑制对TSC-22表达的影响,并为进一步探明TSC-22在心脏成纤维细胞中的确切功能奠定基础。方法采用差速贴壁法原代分离培养Sprague-Dawley大鼠心脏成纤维细胞,分别进行下述实验:①以不同初始密度接种细胞,分为两组:A组为50%融合组:以1.0×105/ml密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,培养24h;B组为100%融合组:以2.0×105/ml密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,培养24h;②均以2.0×105/ml的初始密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,分为4组:A组为未融合组:接种后培养6h(至贴壁未融合状态);B组为融合组:接种后培养24h(至100%融合状态);C组为胰酶消化打破融合组:接种后培养至100%融合后,0.25%胰酶消化,离心混悬后重新贴壁,继续培养6h(此时细胞重新贴壁但未融合);D组为胰酶消化重新达融合组:接种后培养至100%融合后,0.25%胰酶消化,离心混悬后重新贴壁,继续培养24h(此时细胞重新达到100%融合)。以上各组分别提取mRNA和蛋白,应用实时定量PCR(real-time PCR)、蛋白印记(Western blotting)法分别检测TSC-22 mRNA、蛋白表达的变化。结果实时定量RT-PCR和蛋白印记结果表明:①心脏成纤维细胞融合度达到100%,即发生接触抑制时,与50%融合度组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平水平均显著升高(P<0.05);②融合组心脏成纤维细胞与未融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著升高;胰酶消化打破融合组心脏成纤维细胞与融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著下降;胰酶消化重新达融合组成纤维细胞与胰酶消化打破融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著升高(P均<0.05)。结论本实验结果明确表明,在体外培养的心脏成纤维细胞中,接触抑制是诱导TSC-22表达升高的重要因素。当心脏成纤维细胞发生接触抑制时,TSC-22可能通过行使其转录因子的生物学功能,在接触抑制后所触发的信号通路中发挥重要调控作用。对TSC-22确切功能的深入研究,将有助于进一步理解和阐明心脏重构机制。     

加味小陷胸汤含药血清对BAECs增殖及eNOS表达的影响

目的:观察加味小陷胸汤含药血清对牛主动脉内皮细胞(BAECs)的保护作用。方法:以原代培养的牛主动脉内皮细胞为研究对象,采用MTT法检测细胞生长活性,WesternBlot法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。结果:一定浓度(5%、10%、15%)的加味小陷胸汤含药血清能明显促进牛主动脉内皮细胞增殖和eNOS蛋白表达,高浓度(20%)的加味小陷胸汤含药血清能抑制细胞增殖和eNOS蛋白表达。结论:加味小陷胸汤可通过促进牛主动脉内皮细胞增殖和eNOS的表达而起到保护血管内皮细胞的作用。     

M21黑色素瘤细胞与淋巴管内皮细胞相互作用的形态研究

目的：观察恶性黑色素瘤细胞转移时与淋巴管内皮的作用过程，探讨肿瘤淋巴转移的机理。方法：将M21黑色素瘤细胞接种在单层淋巴管内皮上，用相差显微镜和扫描电镜观察肿瘤细胞穿越淋巴管内皮的方式及两者的形态改变。结果：黑色素瘤细胞借胞膜突起与内皮粘附，粘附部位多位于内皮细胞连接处；粘附处的内皮收缩，肿瘤细胞穿越并在内皮下迁移。结论：肿瘤细胞的转移过程包括粘附、浸润和迁移；肿瘤细胞可以直接或通过内皮细胞间隙穿越淋巴管内皮向远处转移。     

血脑屏障体外实验模型的建立

目的:应用培养的CBA/J小鼠脑血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVEC)构建血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的体外实验模型.方法:将BMVEC种植在明胶包被的24孔板细胞插入器的微孔滤膜上培养至汇合状态,通过4 h液面渗漏实验、扫描和透射电镜、血脑屏障形成前后膜两侧的电阻以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的通透性和RMP-7对血脑屏障通透性的调控作用来证实BBB的形成.结果:BMVEC培养至汇合后,4 h液面渗漏实验成为阳性;扫描电镜显示细胞形成单层,透射电镜证实细胞间形成紧密连接;跨细胞电阻(the transendothelial electrical resistance,TEER)分别为汇合前和人脐静脉内皮细胞的3.2倍和7.7倍;对HRP的通透率分别为前对照组的13.4%和6.7%;RMP-7处理使HRP在BBB的通透率增加了2.7倍.结论:构建的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性,适用于中枢神经系统药物跨BBB能力的研究.     

人口腔黏膜上皮细胞的培养

目的:培养人口腔黏膜上皮细胞,建立稳定的人正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系,为进一步采用组织工程技术构建口腔黏膜组织奠定基础。方法:取3个月唇裂患儿手术多余口腔黏膜,经Dispase及胰蛋白酶消化获取细胞,采用无血清角化细胞培养液进行原代培养,并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等细胞定性研究。结果:在0.25×10~2个细胞的低密度接种下,经过20天培养,获得了完全融合成片的口腔黏膜原代细胞,细胞呈铺路石样生长,经鉴定为单一的口腔黏膜上皮细胞。结论:正常口腔黏膜组织经Dispase及胰蛋白酶消化,应用无血清培养液进行培养,可成功培养出人正常口腔黏膜上皮原代细胞。     

A novel mutation in proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 gene leads to familial hypercholesterolemia in a Chinese family

Background Familial hypercholesterolemia （FH） is an autosomal disorder associated with elevated plasma low density lipoprotein （LDL） levels leading to premature coronary heart disease （CHD）. As a result of long-term hyperlipemia, FH patients will present endarterium thickening and atherosclerosis. In the present study we scanned the related gene of a clinically diagnosed autosomal genetic hypercholesterolemia family for the possible mutations and established eukaryotic expression vector of mutation of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 （PCSK9） gene with gene recombination technique to investigate the contributions of the variation on low density lipoprotein receptor （LDL-R） metabolism and function alternation.Methods Mutation detection was conducted for LDL-R, apolipoprotein B100 （apoB100） and PCSK9 gene with nucleotide sequencing in a Chinese FH family. The full-length cDNA of wild type PCSK9 gene （WT-PCSK9） was obtained from Bel-7402. Site mutagenesis was used to establish the recombinant eukaryotic expression vector carrying pathogenic type of PCSK9 gene and the inserted fragment was sequenced. With the blank vector as control, liposome transfection method was used to transfect the Bel-7402 cells with recombinant plasmid. The expression of LDL-R mRNA was examined by RT-PCR. PCSK9 and the expression of LDL-R protein were determined by Western blotting. Results The G→T mutation at the 918 nucleotide of PCSK9 gene resulted in the substitution of the arginine by a serine at the codon 306 of exon 6. After sequencing, it was confirmed that the inserted fragment of established expression vector had correct size and sequence and the mutant was highly expressed in Bel-7402 cells. There was no significant variation in the levels of LDL-R mRNA. LDL-R mature protein was decreased by 57% after the cells were transfected by WT-PCSK9 plasmid. Mature LDL-R was significantly decreased by 12% after the cells were transfected by R306S mutant as evidenced by gray scale scanning, suggesting that the new mutant R306S can significantly decrease the expression of mature LDL-R protein.Conclusions A novel missense mutation of PCSK9 gene, R306S, was found and the eukaryotic expression vectors of mutant and wild-type of PCSK9 gene were established. There was no significant variation in the levels of LDL-R mRNA. The R306S mutation could significantly lead to the decrease of LDL-R mature protein expression, which might be the pathogenic gene of the FH family.     

c-fos mRNA在损伤Balb/c 3T3细胞中的表达

本文以划线损伤方法在Balb/c 3T3细胞造成了纤维母细胞损伤模型,以Northernblot检测了这种刺激对c-fos mRNA表达的影响。结果表明,损伤 30min后就可在 Balb/c 3T3细胞中检出 c-fos mRNA。     

Functional analysis of low-density lipoprotein receptor in homozygous familial hypercholesterolemia patients with novel 1439 C→T mutation of low-density lipoprotein receptor gene

Background Familial hypercholesterolemia （FH）, caused by low density lipoprotein （LDL） receptor （LDL-R） gene mutations, is associated with increased risk of premature coronary heart disease. Until now, limited molecular data concerning FH are available in China. The present study described the clinical profiles and cell biological defects of a Chinese FH kindred with novel LDL-R gene mutation. Methods The patient＇s LDL-R gene coding region was sequenced. The patient＇s lymphocytes were isolated and the LDL-R expression, binding and up-take functions were observed by immunohistochemistry staining and flow cytometry detection. The patient＇s heart and the major large vessels were detected by vessel ultrasound examination and myocardial perfusion imaging （MPI）. Results The patient＇s LDL-R expression, LDL binding and up-take functions were significantly lower than normal control （39%, 63% and 76% respectively）. A novel homozygous 1439 C→T mutation of the LDL-R gene was detected in the patient and his family. ECG showed atypical angina pectoris. Echocardiogram showed stenosis of the coronary artery and calcification of the aortic valve and its root. Blood vessel ultrasound examination showed the thickness of large vessel intima, and the vessel lumen was narrowed by 71%. MPI showed ischemic changes. Conclusions The LDL-R synthesis dysfunction of FH patients leads to arterial stenosis and calcification, which are the major phenotype of the clinical disorder. The mutation of the LDL-R gene is determined. These data increase the mutational spectrum of FH in China.     

卡托普利、地尔硫卓、多巴酚丁胺对主动脉血管内皮细胞单层通透性的影响

目的：探讨血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利、钙离子拮抗剂地尔硫　和β－激动剂多巴酚丁胺对大鼠主动脉血管内皮细胞单层通透性的影响。方法：大鼠主动脉内皮细胞（ＡＥＣ）培养采用陈思锋的无创性分离法分离培养；将ＡＥＣ培养在混合纤维素酯微孔滤膜上，培养８ｄ后进行通透性测定。长有ＡＥＣ的滤膜分别用卡托普利、地尔硫　和多巴酚丁胺处理４ｈ，置于灌注装置上，用含异硫氰酸荧光素标记白蛋白的高脂血灌注，测定收集液的量和白蛋白浓度，同时采用酶联法测定滤出液的总胆固醇（Ｔｃｈ）、甘油三酯（ＴＧ）、载脂蛋白Ａ和Ｂ（ａＰＡ、ａＰＢ）浓度。结果：三种药物均可降低ＡＥＣ对水、Ｔｃｈ、ＴＧ、ａＰＡ和ａＰＢ的通透性，其中多巴酚丁胺作用最为显著。而对白蛋白清除率除地尔硫　作用较显著外，其他两药均无明显作用。结论：卡托普利、地尔硫　和多巴酚丁胺可减少脂类和载脂蛋白渗入血管内皮下，从而预防和改善动脉粥样硬化。