抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

S100A2基因cDNA克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的：克隆S100A2 cDNA、构建S100A2重组表达载体并在肝癌细胞QGY7701中进行表达。方法：应用RT-PCR和DNA重组技术构建绿色荧光蛋白（EGFP）-S100A2融合蛋白表达载体，经脂质体导入QGY7701细胞中进行表达。应用荧光显微镜直接观察EGFP-S100A2融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性细胞克隆。结果：构建了带有EGFP的S100A2重组表达载体命名为EGFP-C2-A2，并在肝癌细胞QGY7701中获得了表达。荧光显微镜下可见EGFP-S100A2融合蛋白定位于胞浆及胞核，而pEGFP载体对照之EGFP只定位在胞浆中。结论：EGFP-S100A2融合蛋白能够在肝癌细胞QGY7701中获得表达，各自在细胞中的定位互不受影响，推断此融合蛋白具有各自的生物学活性。     

人CD4基因在大肠杆菌中的表达

本文设计并化学合成了一对ＰＣＲ引物，以人ＣＤ４ｃＤＮＡ为模板，成功地扩增出人ＣＤ４Ｎ端两个结构域的编码基因（６００ｂｐ），并在此基因两端分别插入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点及起始和终止码。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将ＣＤ４基因克隆入ｐＵＣ１９质粒，经过ＰＣＲ和酶切鉴定得到ＣＤ４重组克隆ｐＴ４０３。ＤＮＡ序列分析结果表明，所克隆ＣＤ４基因与已发表的人ＣＤ４基因序列完全一致。将ＣＤ４基因     

Syntaxin 4蛋白在NK细胞中的表达及与SNAP-23蛋白的相互作用

目的　研究NK细胞中与囊泡分泌有关的膜蛋白syntaxin 4的表达和与其它蛋白的相互作用 ,为进一步研究NK细胞免疫效应的分泌调节分子机制提供新思路。方法　RT PCR和免疫印迹方法检测人类NK细胞syntaxin 4的表达 ,免疫荧光显微镜观察静息状态和经靶细胞激活后syntaxin4蛋白在NK92细胞中表达和分布的变化 ,免疫共沉淀检测syntaxin 4蛋白和SNAP 2 3蛋白的相互作用。结果　人类NK细胞中在mRNA水平和蛋白质水平均有syntaxin 4组成性表达 ,蛋白产物主要分布在细胞膜上。异种靶细胞刺激后 ,syntaxin 4蛋白有明显的细胞内定位变化和极化现象。syntaxin 4蛋白和SNAP 2 3蛋白有较强的相互作用。结论　syntaxin 4蛋白与NK细胞对靶细胞的识别过程有关 ,并与胞内膜交换相关分子SNAP 2 3蛋白相互作用 ,可作为研究干预移植排斥反应中杀伤性胞吐的新目标分子。     

PTEN基因的克隆及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人抑癌基因PTEN全长cDNA,构建其真核表达载体并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法采用RT-PCR法从人正常肝组织中扩增PTEN全长cDNA,将之与pMD18-T Simple Vector连接、测序,获得PTEN基因。将该基因与pcDNA3·1( )载体连接,构建pcDNA3.1-PTEN真核表达载体。用该载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PTEN的表达。结果酶切和测序证实PTEN基因克隆和真核表达载体构建成功。HepG2-PTEN细胞中PTEN mRNA的表达显著高于未转染的HepG2细胞。结论人抑癌基因PTEN在人肝癌细胞系HepG2细胞中能够高效、稳定地表达,为其在肝癌基因治疗研究中的应用奠定了基础。     

CD226(PTA1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究

目的 :研究CD2 2 6分子在NK细胞克隆上的表达及功能。方法 :用有限稀释法建立NK细胞克隆并鉴定。采用重导向杀伤实验 (redirectedcytotoxicityassay ,RCA)观察CD2 2 6单克隆抗体对NK细胞克隆杀伤作用的影响 ,并用ELISA方法检测杀伤相培养上清中细胞因子水平的动态变化。结果 :获得 1株NK细胞克隆。在重导向杀伤实验中 ,CD2 2 6单克隆抗体能明显提高NK细胞克隆的杀伤水平 ;促进NK细胞克隆IFN γ和GM CSF的分泌。结论 :CD2 2 6是一种新的NK细胞活化性受体 ,IFN γ和GM CSF水平升高可能与NK细胞克隆功能有关。     

NK4基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

本研究构建携带人NK4基因的慢病毒载体,并将其转染人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),明确转染后NK4表达情况。通过聚合酶链反应从HGFcDNA文库中克隆NK4基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pGC-FU-NK4,实时定量PCR检测病毒滴度。所获慢病毒(Lenti-NK4)转染hBMSCs后,荧光显微镜下观察荧光表达。ELISA检测培养上清中NK4表达。结果显示,所获NK4基因测序后与GeneBank报到序列完全一致,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×108TU/ml。Lenti-NK4转染hBMSCs后胞膜及胞浆有荧光分布,培养上清中NK4含量随感染时间延长而增加。提示携带NK4的慢病毒能安全、有效地转染hBMSCs,持续稳定表达。     

转染外源HCAP1基因对B淋巴瘤细胞株Raji细胞增殖的作用

目的：HCAP1基因定位于人类染色体17p13.3，此区域在多种肿瘤组织呈杂合性缺失，本研究旨在探讨HCAP1外源基因产物对B淋巴瘤细胞系Raji细胞增殖的作用。 方法: 应用脂质体介导法，将HCAP1基因转染Raji细胞，经G418筛选、获得稳定表达外源HCAP1基因的细胞，用台盼蓝活细胞计数、绘制生长曲线、软琼脂集落培养及BrdU（5溴-2'脱氧尿嘧啶）标记法，观察HCAP1基因产物对Raji细胞增殖的作用。 结果： 与转染空载体的对照细胞比较，稳定表达外源HCAP1基因的细胞生长速度明显减慢，倍增时间明显延长，细胞集落形成数明显减少，BrdU掺入细胞比例降低。 结论： 外源HCAP1基因产物的过表达对Raji细胞的增殖有抑制作用。     

CD4+ NK cells can be productively infected with HIV, leading to downregulation of CD4 expression and changes in function

NK cells mediate the innate immune response, and HIV-infected individuals demonstrate altered NK cell phenotype and function. We find that CD4+ NK cells are susceptible to HIV infection; this could account for the NK cell dysfunction seen in HIV-infected individuals. CD4+ NK cells express CXCR4 and can be infected with X4-tropic viruses and some primary R5-utilizing viral isolates. Treatment with the CXCR4 ligands AMD3100 and SDF-1α partially blocks infection with X4-tropic virus, treatment with anti-CCL Igs upregulates CCR5 surface expression and enables infection with HIV-Bal. HIV infection of NK cells results in CD4 downregulation and the production of infectious virus. HIV-infected CD4+ NK cells mediate NK cell cytotoxicity, however, HIV infection is associated with decreased chemotaxis towards IL-16. Thus, HIV infection of CD4+ NK cells could account for the NK cell dysfunction observed in HIV-infected individuals. Furthermore infected NK cells could serve as a viral reservoir of HIV in vivo.     

Bidirectional NK/DC interactions promote CD4 expression on NK cells, DC maturation, and HIV infection

Interactions between natural killer (NK) and dendritic cells (DCs) are integral to immune response development, potentially leading to bidirectional NK/DC activation. We demonstrate that autologous NK/DC interactions induce CD4 expression on NK cells, influencing degranulation. Cell contact is required, with high NK:DC ratios and mature DCs most effectively inducing CD4 expression. CD4(+) NK cells, in turn, mediate DC maturation via contact-dependent and independent pathways, more effectively maturing DCs than CD4(-) NK cells. Bidirectional NK/DC interactions also impact HIV infection, as NK-matured DCs effectively deliver infectious HIV to T cells, via trans-infection. DC-induced CD4 expression also renders NK cells susceptible to HIV infection. Focusing on NK/DC interactions, DCs can transfer infectious virus and enhance HIV infection of CD4(+) NK cells, strongly suggesting that these interactions influence HIV pathogenesis. Findings provide new insight regarding NK/DC interactions, defining a mechanism by which cellular interactions in the absence of pathogens promote DC-mediated amplification of HIV infection.     

去氢表雄酮及G6PD基因反义寡核苷酸对Raji细胞的某些影响

目的:观察去氢表雄酮（DHEA）及G6PD基因的全硫代修饰反义寡核苷酸对体外培养Raji细胞的抑制作用。 方法:分别用不同浓度DHEA及G6PD反义寡核苷酸作用于体外培养Raji细胞，观察细胞存活、生长情况，同时采用逆转录-聚合酶链反应检测Raji细胞G6PD基因mRNA表达水平，测定G6PD活性。 结果:DHEA及G6PD反义寡核苷酸不影响Raji细胞存活，50 μmol/L、500μmol/L浓度的DHEA作用72 h小时及10.0 μmol/L反义寡核苷酸作用48 h后均明显抑制Raji细胞生长（P＜0.01）；当DHEA≥5.0 μmol/L时，作用Raji细胞72 h，则G6PD活性明显低于未用DHEA作用的对照组（P＜0.01），但不影响G6PD基因mRNA表达；10.0 μmol/L反义寡核苷酸作用Raji细胞48 h后，G6PD基因mRNA表达水平低于未用反义寡核苷酸作用的对照组，G6PD活性亦明显低于对照组（P＜0.01）。 结论:一定浓度的DHEA及G6PD反义寡核苷酸均能抑制Raji细胞G6PD活性并不同程度影响细胞生长，但其抑制机制不同。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP 16产生抗凋亡作用     

Gene expression analysis of activating and inhibitory receptors of natural killer cells in patients with acute myeloblastic leukemia

PurposeNatural killer (NK) cells are cytotoxic lymphocytes, which have long been known to play an essential role in immune surveillance of tumor cells. The results of several clinical studies imply evidence of impaired activity of NK cells in acute myeloblastic leukemia (AML). The aim of this study was to investigate the gene expression of activating and inhibitory receptors of NK cells in patients with newly diagnosed AML before and after induction therapy using 7 + 3 regimen in comparison to healthy donors.Materials and methodsSixteen AML patients aged 16–64 years as well as 16 matched healthy individuals were studied. Peripheral blood samples from patients were obtained in two steps, namely, in newly diagnosed patients and 28 days after receiving induction therapy. Real-time PCR was performed to evaluate the expression levels of activating receptors, including DNAM-1 and NKp46 as well as inhibitory receptors of KIR2DL1 and NKG2A.ResultsOur results demonstrated that the newly diagnosed patients showed over 50% decrease in NKp46 expression and a 6-fold increase in KIR2DL1 expression compared to healthy controls. The mRNA expression analysis in patients after induction therapy suggested a significant decrease in mRNA expressions of KIR2DL1 and NKG2A in comparison to newly diagnosed patients.ConclusionHerewith, we show a statistical difference in mRNA expression levels of activating (NKp46) and inhibitory receptors from NK cells in newly diagnosed AML patients when compared with healthy controls or patients who received induction therapy, supporting the findings of researchers who reported the impaired NK cells cytotoxicity in AML patients.