分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的 研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针，探针的5’端标记6-fluorescine(6-FAM)，3，端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoicacid(DABCYL)，对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果 肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袋型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104．5、85．9、83．1、94．8、46，1，Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121．3、64．2、45.6、42．8、54．5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21，结果阳性，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论 分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。     

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。     

LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用

目的：建立一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,反应快速检测沙门茵的方法。方法：根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA（登录号：M90846和M18283）基因序列,设计特异引物,提取标本DNA,然后以LAMP技术扩增invA基因,PCR方法扩增厅棚基因,采用琼脂糖电泳观察结果。结果：91份血培养阳性报警瓶,LAMP和PCR法检测出阳性18份,与最终培养结果一致;30份粪便标本,LAMP和PCR法检测出阳性5份,培养阳性3份,LAMP测限达到10^2CFU／mL。结论：LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。     

沙门菌PCR检测技术应用进展

沙门菌是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统检测方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足快速检测要求。聚合酶链反应（PCR）技术是近年来广泛应用于食品中沙门菌快速检测的方法之一,其检测目的基因多种多样,主要包括属特异性引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物基因。本文主要概述PCR技术应用于沙门菌检测的各种目的基因,并简要介绍常规PCR、多重PCR及实时定量PCR等技术的应用。     

4例多重耐药非伤寒沙门菌的耐药基因和分子分型

目的 研究中山市多重耐药非伤寒沙门菌株的耐药基因和分子分型特征。 方法 分析2015年7月中山市博爱医院培养出的4例多重耐药NTS菌株的药敏结果,并且对该4例菌株进行脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）多位点序列分型技术（MLST）和全基因组测序分析（WGS）,并在此基础上对4例菌株进行差异性分析,量化菌株之间的遗传发育距离,确定病例菌株之间的关系。 结果 4例菌株均为鼠伤寒沙门菌变种,并且均为多重耐药菌株,菌株S2、S3和S4药敏结果几乎相同,与S1差异较大。PFGE可将4例菌株分为两个大组（组A和组B）,菌株S2、S3、S4落到同一个大组B中,菌株S2、S3、S4抗原式相同并均与S1有差异;MLST发现菌株S1为ST19型,菌株S2、S3、S4为ST34型。菌株S1抗药基因谱与菌株S2、S3、S4差异大,菌株S2、S3和S4 均有blaCTX-M-55基因。菌株S2、S3和S4的WGS形似度非常高,几乎可确定为同一来源。 结论 4例多重耐药菌株均为鼠伤寒沙门菌变种,菌株S2、S3和S4为同一来源。 blaCTX-M-55基因可能是造成本次中山市NTS多重耐药的主要原因之一。     

广东省中山市2017年沙门菌耐药菌谱及分子分型分析

目的 了解中山市2017年沙门菌的耐药特征及分子分型,为临床合理用药和食源性疾病的溯源提供科学依据。方法 对中山市2017年食源性疾病监测（3个哨点医院）的沙门菌分离株采用微量肉汤稀释法进行14种抗生素药敏试验,运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对肠炎沙门菌进行分子分型。 结果 中山市2017年食源性疾病监测检出的285株沙门菌对14种抗生素敏感性试验结果显示,237株（占83.16％）沙门菌对13种抗生素呈现不同程度的耐药性,未发现对亚胺培南（IPM）耐药菌株。耐药抗生素最多的种类达到11种,耐药率较高（40 %以上）的抗生素为氨苄西林（AMP）、四环素（TET）、氨苄西林/舒巴坦（SAM）、氯霉素（CHL）;共有87类耐药谱型,其中多重耐药谱型75类（86.21%）,多重耐药菌株数为176株（61.75%）。25株肠炎沙门菌的PFGE分为5种带型,相似度为63.9%~100.0%。结论 中山市2017年食源性疾病监测显示沙门菌耐药状况较为严重,呈多重性和多态性,应采取综合措施控制耐药性;肠炎沙门菌PFGE的相似度较高,存在优势带型。     

沙门菌耐药性及其耐消毒剂基因的分析

目的 分析沙门菌耐药性,并检测其耐消毒剂基因.方法 收集2017年9月至2019年9月佛山市禅城中心医院从社区环境中分离并经培养鉴定为沙门菌的菌株,共计185株.采用血清凝集实验鉴定菌型;采用琼脂扩散法进行药敏实验;采用实时荧光定量PCR法检测qacA/B、qacE△1、smr、qacG、qacJ基因;采用最小抑菌浓度...     

瑞安市腹泻患者沙门菌耐药性和分子分型研究

目的 了解瑞安市腹泻患者沙门菌的血清型、耐药性和分子分型特征。方法 收集2016—2019年从瑞安市人民医院收治的腹泻患者中分离的沙门菌进行血清学分型,采用K-B纸片法进行药物敏感性试验,利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型。结果 共收集到134株沙门菌,分为24个血清型,其中鼠伤寒沙门菌52株（38.8%）,肠炎沙门菌31株（23.1%）,伦敦沙门菌13株（9.7%）。沙门菌血清型分布在12岁以下组和21～60岁组患者间存在统计学差异（P<0.05）。沙门菌对氨苄西林的耐药率最高,达73.1%;肠炎沙门菌对萘啶酸耐药率达到100%;鼠伤寒沙门菌对萘啶酸的耐药率为48.1%;相比肠炎沙门菌,鼠伤寒沙门菌对复方新诺明、氯霉素、甲氧苄啶、四环素的耐药率更高。随机抽取40株沙门菌进行PFGE,结果得到29种带型,菌株相似度为63%～100%。结论 不同年龄组患者分离的沙门菌血清型构成不同。沙门菌多重耐药形势严峻,鼠伤寒沙门菌的耐药性普遍高于其他血清型;对阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、亚胺培南、氨曲南具有较高敏感性。鼠伤寒沙门菌在分子水平存在一定程度的分化,而肠炎沙门菌分化程度不高...     

单侧延长臂分子信标探针芯片在结核杆菌检测中的运用研究

目的分子信标探针在芯片表面的固定结合是限制其在芯片技术领域运用的难题。本研究拟寻找一种将分子信标探针固定在芯片表面的新方法,同时对其中重要影响因素进行优化探讨。方法本实验设计一种带单侧延长臂分子信标探针,固定在芯片表面进行杂交、扫描等后续实验。提高杂交效率部分优化包括：分子信标探针浓度;杂交温度、杂交时间;杂交液配方;4种分子对分子信标荧光信号比较。结果较理想区分阴阳性信号强度理想的探针浓度：Cy3-BDH分子信标探针浓度约10μmol/L,FAM-DABCLYE约15μmol/L。讨论单侧延长臂分子信标特异性高、敏感性高、技术难度低,对中、高密度芯片杂交可做到“点对点杂交”。     

南通市沙门菌毒力基因分布特征的初步研究

目的对南通市分离的沙门菌进行毒力基因检测,了解其携带毒力基因的情况,探索毒力基因用于沙门菌分型的可能性。方法运用生物化学、血清凝集等实验对实验菌株进行鉴定,使用多重引物PCR方法对经鉴定的沙门菌进行毒力基因检测。结果11个被检测的毒力基因invA、orgA、prgH、spaN、tolC、sipB、sitC、pagC、msgA、spiA及iroN在所有菌株中都存在;另5个基因,在菌株中的存在情况不同,lpfC和sifA基因在阿贡纳和德尔卑中存在更广泛（80%、90%和73%、77%）;cdtB、pefA和spvB基因在实验菌株中的检测阳性率不高,并且只存在于少数几个血清型（埃森和德尔卑）。结论南通市分离的沙门菌携带多种毒力基因,且菌株之间有一定差异,毒力基因用于基因分型有待于进一步探讨。     

结核分支杆菌分子信标探针荧光芯片固定方式的研究

目的研究结核分支杆菌分子信标探针荧光芯片的固定方式。方法通过对传统生物素（biotin）-亲和素（avidin）连接方式和自行设计的单侧延长臂的分子信标连接方式的对比研究,对TB分子信标与芯片固定方式进行探索。结果生物素-亲和素（biotin-avidin）能很好地结舍在芯片上但这种修饰有相当技术难度;且生物素一亲和素连接无特异性。本设计单侧延长臂分子信标采用淬灭分子中间标记,茎结构单侧（淬灭分子一侧）延长臂,能很好的结合在芯片上,且修饰技术难度低、特异性高。结论单侧延长臂分子信标探针设计的发明及运用,初步解决了分子信标技术在芯片技术领域运用的固定难题。巧妙地把分子信标高特异性、高灵敏性等优势自然运用到芯片技术上。     

分子信标实时PCR检测瘢痕相关p53基因SNP方法的建立

目的建立分子信标实时PCR检测病理性瘢痕相关p53基因第72密码子单核苷酸多态性的新方法。方法采集瘢痕疙瘩患者外周血28例,提取DNA并用分子信标PCR检测p53基因多态性。设计一对p53基因第72密码子单核苷酸多态性荧光分子信标探针,荧光定量PCR检测该位点单核苷酸(SNP),并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。结果定量荧光PCR荧光分子信标检测的结果与测序结果吻合率达到100%,高于反向斑点杂交法且简便快捷。结论分子信标实时PCR检测技术适合临床p53基因第72密码子单核苷酸多态性快速诊断。     

荧光显微观测Rpsl基因突变DNA分子探针杂交研究

目的选择结核杆菌耐链霉素（Sm）Rpsl基因包含88codon突变位点的序列设计分子信标,建立扩增体系及分子信标芯片检测方法。方法运用软件：Beacondesigner设计Rpsl基因包含88eodon突变位点的分子信标及及其单侧延长臂分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法,应用荧光显微镜观测荧光信号。结果通过荧光显微镜观测到标准株及耐SM株PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;51株耐链霉素（SM）与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,P〈0．05和P〈0．01的耐SM组Rpsl基因88codon突变检出率为61％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术。单侧延长臂分子信标对解决分子信标在芯片表面固定难题提供了一种有效方法,采用荧光显微镜观测荧光信号具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点。     

核酸序列依赖扩增联合分子信标对曲霉菌感染的检测效果

目的建立快速、灵敏、特异的定量检测曲霉菌感染的诊断方法。方法以烟曲霉菌、黄曲霉菌及黑曲霉菌的孢子配制菌液,提取RNA后,采用核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)联合分子信标(molecular beacon,MB)技术进行荧光检测,并对该方法进行灵敏度和特异性分析。结果扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与标本中霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-10.7x+81.6,r=0.988)。将含有梯度数量霉菌孢子的标本提取总RNA后进行检测,可建立相应标准曲线。该方法的灵敏度可达到1个孢子;对照菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌)与曲霉菌提取总RNA经扩增后的产物进行电泳分析,发现仅曲霉菌出现特异性条带。结论 NASBA结合分子信标检测曲霉菌具有灵敏度高、特异性强的特点,具有潜在利用价值,有望成为曲霉菌感染的临床诊断方法。     

改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法，应用于霍乱监测。方法：根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，并进行特异性和灵敏度分析；同时以11种细菌作对照，建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系，应用于霍乱监测。结果：霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌，只有霍乱弧菌有荧光信号，与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为102．4fg／ul，菌液灵敏度为32cfu／ml或3cfu／PCR反应体系。对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测，结果都为阴性。检测时间仅需2h。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强，可用于霍乱的快速诊断，为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

分子信标实时定量PCR法检测胃癌中Survivin基因mRNA的表达

目的 采用分子信标实时定量PCR方法检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的表达量，并分析其与临床资料之间的关系。方法 设计Survivin基因特异性分子信标探针和引物，以cDNA克隆重组质粒为标准品，建立Survivin基因实时定量检测方法；并检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的模板拷贝数。结果 Survivin基因mRNA分子信标实时定量检测方法的线性范围为10^3-10^10拷贝数，批间变异为28．16％，批内变异为13．34％，灵敏度为42个拷贝数，平均回收率为109．83％；胃癌组织、癌旁组织和正常组织以及胃良性病变组织间比较，mRNA模板拷贝数差异有显著性（P〈0．05）；胃癌样本中mRNA模板拷贝数与淋巴结转移和2年生存期以及病理类型相关（P〈0．05）。结论 成功建立Survivin基因分子信标实时定量检测方法。胃癌中该基因表达的模板拷贝数可作为预测淋巴结转移、评价预后的一个重要指标。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。