阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景：基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的：评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点：以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料：质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法：首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标：采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因（绿色荧光蛋白基因pGFP-N2）,分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果：Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论：对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。     

阳离子脂质体介导转染核酸的研究

阳离子脂质体介导转染法是一种新的高效转染技术 ,已逐渐成为介导核酸进入真核细胞的标准方法。但由于大多数的阳离子脂质体的血清稳定性差 ,且阳离子脂质体与体内网状内皮细胞系统的关系不明 ,在一定程度上限制了其体内的应用     

阳离子脂质体介导转染核酸的研究

阳离子脂质体介导转染法是一种新的高效转染技术，已逐渐成为介导核酸进入真核细胞的标准方法。但由于大多数的阳离子指质体的血清稳定性差，且阳离子脂质体与体内网状内皮细胞系统的关系不明，在一定程度上限制了其体内的应用。     

超声微泡破裂法联合阳离子脂质体介导基因转染的实验研究

目的 探讨超声微泡破裂法联合阳离子脂质体(cationic liposome,CL)介导绿色荧光蛋白质粒在肝癌细胞(HepG2)基因转染的可行性,并探索最佳转染条件.方法 依次采用培养液中是否含有血清和不同的CL浓度、不同超声辐照时间点、不同纳米级脂质微泡造影剂(nano-liposomal bubble,NB)浓度等处理因素进行细胞基因转染.荧光显微镜和流式细胞仪检测基因转染效率,CCK-8法检测细胞活性,以获得优化的转染参数.结果 血清能降低CL的细胞毒性,但对基因转染效率无明显影响,CL与质粒DNA质量比4∶1时可以达到相对高效低毒的转染效果,转染率(17.71±0.79)％,存活率(91.28±0.76)％.CL联合1h时间点辐照超声可以提高转染率至(24.85±0.78)％(P＜0.01),加入10％的NB可进一步提高转染率至(32.47±4.01)％(P＜0.05).结论 超声微泡破裂法可以有效增强CL介导的基因转染,联合应用为基因治疗提供了新思路.     

脂质体介导HBcAg基因转染人树突状细胞的实验研究

目的通过脂质体介导乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因转染人体内专职抗原提呈的树突状细胞(DC)的方法,使HBcAg基因在树突状细胞中表达,构建树突状细胞疫苗。方法分离健康人外周血单个核细胞,在粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)的诱导下培养DC。在培养的第5天,应用脂质体PEI介导将含有编码HBcAg 基因的质粒(pJW4303／HBc)转染入DC,再以免疫印迹技术(Western-Blotting)验证其表达产物。结果经以质粒pJW4303 为真核表达载体的HBcAg目的基因转染后的树突状细胞有效表达了HBcAg抗原。结论经该方法转染后的DC目的基因可有效表达HBcAg,为以DC为基础的免疫治疗奠定了新的基础。     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景:近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的:探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法:以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论:采用脂质体LipofectamineTM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×108L-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1:3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高(P<0.01),而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景：近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的：探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法：以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine^TM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论：采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×10^8L^-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1：3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高（P〈0.01）,而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景：与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染。目的：介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展。方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库（CNKI：1987/2010）和PubMed（1987/2010）数据库,检索词分别为＂基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制＂和＂gene therapy,cationic liposome,gene transfer,mechanism＂,语言分别设定为中文和英文。从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制。结果与结论：共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章。综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容。结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键。     

阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景:与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染.目的:介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展.方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:1987/2010)和PubMed (1987/2010)数据库,检索词分别为"基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制"和"gene therapy,cationic liposome,gene transfer,mechanism",语言分别设定为中文和英文.从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制.结果与结论:共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章.综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容.结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键.     

三种阳离子脂质体介导血管内皮细胞基因转染效率的比较

目的:评价不同阳离子脂质体介导基因转染血管内皮细胞的转染效率。方法:实验于2006-12/2007-02在中山大学生化实验室及广州市创伤外科研究所完成。采用增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectin、Lipofectamine、Dosper3种不同的阳离子脂质体为载体,转染人脐静脉血管内皮细胞。在24孔板中,每孔加入人脐静脉血管内皮细胞悬液(1×106个细胞),各孔分别加入3种不同阳离子脂质体增强型绿色荧光蛋白质粒复合物,分别于培养24,48h后用荧光显微镜及流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白在细胞内的表达及转染效率。结果:3种不同阳离子介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉血管内皮细胞内均有绿色荧光蛋白表达,24h后明显,48h后达高峰。Dosper介导组绿色荧光细胞百分比明显高于Lipofectin介导组及Lipofectamine介导组,差异有非常显著意义(P<0.01)。结论:Dosper介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,较适合作为血管内皮细胞的基因转染载体。     

筛选介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳试剂

背景:理想的细胞转染试剂应具有高效安全的特点。目的:筛选能够高效介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳转染试剂。方法:应用Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine2000和DharmaFECT1转染试剂介导FAM-siRNA和多药耐药基因MDR1siRNA转染原代肝癌细胞,分别于转染6和48h后应用流式细胞仪和实时荧光定量PCR检测转染效率,然后用MTT法检测3种转染试剂处理原代肝癌细胞24h后的细胞毒性。结果与结论:对于Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine2000和DharmaFECT1转染试剂介导的FAM-siRNA和MDR1siRNA转染,流式细胞仪和实时荧光定量PCR仪检测出RNAiMAX转染效率最高(P<0.05),分别为70.3%和71.5%。MTT法检测结果表明RNAiMAX对原代肝癌细胞没有表现出细胞毒性。结果提示,由于RNAiMAX介导的FAM-siRNA和MDR1siRNA转染的效率最高,并且对细胞的毒性最小,所以RNAiMAX是最适合介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的转染试剂。     

特异性hTERT-siRNA介导RNAi在Hela细胞中的实验研究

目的:探讨RNA干扰对宫颈癌Hela细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制效应.方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个siRNA片段和1个阴性对照小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)片段,分siRNA1-4、control siRNA和空白对照组共6个组,分别用阳离子脂质体转染法将其导入Hela细胞内,通过RT-PCR和Western Blot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:siRNA-3组端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平明显下降,hTERT蛋白表达明显下降.细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向于hTERT的siRNA能特异性抑制宫颈癌Hela细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据.     

两种转染人宫颈癌HeLa细胞的方法学比较

目的比较两种不同的转染方法,即Lipofectamine2000和Nucleofector Kit转染人宫颈癌Hela细胞的转染效率。方法分别选取Lipofectamine2000转染和Amax核电转(Amax Nucleofector Kit)两种转染方法。HeLa细胞培养贴壁达到85%~90%后传代获取HeLa单细胞悬液,细胞分成2管,其中1管直接采用核电转法转染红色荧光蛋白(DsRed)后种植于1.5 ml的细胞培养皿;另一管先种植于细胞培养皿,待贴壁24 h后采用Lipofectamine2000转染DsRed。细胞的存活率采用台盼兰进行检测。分别比较两者转染效率及转染前后细胞的存活率,进一步探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。结果 Lipofectamine2000的基因转染率仅为20.23%,而核电转法的转染率为90.14%,后者为前者的4.46倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为96.34%和90.76%,而核电转组分别为95.98%和78.35%。结论细胞核电转法能高效稳定地转染人宫颈癌细胞株HeLa细胞。     

Microtubule involvement in the intracellular dynamics for gene transfection mediated by cationic liposomes

The effects of microtubule polymerization on liposome-mediated gene transfection were investigated by confocal laser scanning microscopy in target living cells. Both nocodazole and taxol apparently increased the efficiency of gene transfection. Lipofection with fluorescence-labeled cationic liposomes in a COS-7 cell expressing yellow fluorescent protein (YFP)-tagged tubulin revealed that the liposomes were transported along microtubules to lysosomes which are colocalized with the microtubule organizing center (MTOC). Nocodazole disrupted microtubules and produced a uniform distribution of YFP-tagged tubulin in the cytoplasm. Under these conditions, both liposomes and lysosomes were scattered throughout the cytoplasm and they did not colocalize. In the presence of taxol, microtubules were stabilized and several focal regions, like the MTOC, were formed. Lysosomes resided around the nucleus, while liposomes were trapped in microtubules. Under these conditions, neither liposomes nor DNA colocalized with lysosomes. These results demonstrated that the liposome-DNA complexes are transported to lysosomes by a microtubule-mediated pathway, and the effects of nocodazole and taxol on transfection efficiency can be explained by failure of the transport of the liposome-DNA complexes to lysosomes where DNAs are degraded.     

体外合成特异siRNA及其对Hela细胞端粒酶基因表达抑制的研究

目的 针对端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因不同片断合成2条siRNA,比较其对Hela细胞端粒酶基因表达干扰作用的强弱,从而选择出更好的干扰靶位点.方法 用T7RNA聚合酶在体外转录合成siRNA,将合成的2段siRNA转染Hela细胞,对其干扰作用进行分析、鉴定.结果 用2段合成的特异siRNA转染Hela细胞...     

自制阳离子纳米泡介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 观察自制阳离子纳米泡作为基因转染载体体外转染肝癌细胞系HepG2细胞的可行性.方法 将脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和全氟丙烷声振后制得微囊带有PEI的阳离子脂质体纳米泡(PNB),评价其基本特性,用其转染HepG2细胞,并辐照超声,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞转染率,CCK-8法评估其细胞活性.结果 制备的PNB表面带有正电荷,能阻碍质粒DNA在电场作用下发生迁移,且能有效地转染HepG2细胞,转染效率达30％～45％,辐照超声后转染效率明显提高(P＜0.05).结论 新型阳离子纳米泡在体外可作为基因转染载体,有效地携带质粒DNA并促进转染,辐照超声可使转染效率显著提高.     

腺病毒介导p27基因转染对HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察p27基因对人宫颈癌细胞HeLa增殖及凋亡的影响.方法 将已构建成功的腺病毒载体Ad-p27转染至宫颈癌细胞系HeLa细胞,Western blotting法检测病毒转染后p27蛋白在不同时间点表达;噻唑兰(MTT)法检测其对肿瘤细胞增殖的影响;流式细胞术检测其对肿瘤细胞凋亡的影响.结果 HeLa细胞成功转染进Ad-p27;在各观察的时间点内,与对照组比较,同一时间点的细胞中p27蛋白水平均显著增加(P<0.01),细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞凋亡率则显著增加(P<0.01).结论 p27基因抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,腺病毒构建p27基因有望成为宫颈癌治疗的一个新方法.     

在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控

背景:mi RNA通过调节特异靶基因的表达,在疾病的发展及预后中起着重要作用。目的:探索mi RNA-21在宫颈癌Hela细胞中对TLR4基因的调控关系。方法:通过miR NA靶基因预测网站寻找可能与miR NA-21相互作用的靶基因,利用已构建的携带pri-mi RNA-21基因重组腺病毒载体,包装并大量扩增病毒感染Hela细胞,检测荧光蛋白的表达水平,提取感染48 h蛋白,通过Western印迹检测TLR4蛋白表达。从蛋白水平验证在Hela细胞中mi RNA-21与靶基因TLR4的靶向调控关系。结果与结论:100 MOI的重组腺病毒p Ad/pri-miR NA-21、p Ad/neg可以成功感染Hela细胞。生物信息学方法显示mi RNA-21和TLR4存在可能的结合位点。发现感染pA d/pri-miR NA-21组与对照组pA d/neg及空白组相比,TLR4蛋白的表达量明显降低。证实了mi RNA-21可以负调节靶基因TLR4的表达。     

阿司匹林对宫颈癌Hela细胞COX-2mRNA表达的抑制作用

目的研究COX-2非选择性抑制剂阿司匹林（Aspirin）对宫颈癌细胞株Hela的细胞增殖的抑制作用及COX-2mRNA表达量的影响。方法Hela细胞分4组培养在6孔板上设对照组及实验组，观察不同剂量阿司匹林作用后细胞的增殖状态及采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PcR）检测阿司匹林作用前后Hela细胞COX-2mRNA量的变化。结果阿司匹林能抑制Hela细胞增殖及细胞中COX-2mRNA的转录，且抑制强度随阿司匹林的浓度的提高而增加。结论体外阿司匹林抑制癌细胞Hela生长，并从mRNA水平抑制COX-2蛋白的表达，对宫颈癌可能有潜在治疗意义。     

载脂蛋白E修饰的Lipofectamine 2000靶向转染HepG2细胞的实验研究

目的制备载脂蛋白E(ApoE)修饰的Lipofectamine 2000作为基因运载体,并研究其对肝癌HepG2细胞的靶向性和毒性作用。方法构建ApoE修饰Lipofectamine 2000运载体,通过DNA包裹实验检测脂质体与DNA结合的能力,分析脂质体包裹DNA的结合比。脂质体包裹p Genesil-1质粒转染HepG2细胞,通过荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率。MTT实验研究脂质体对HepG2细胞的毒性作用。采用t检验进行两两数据之间的比较,实验数据以均数±标准差(sx±)表示,P<0.05为差异具有统计学意义。结果成功制备了ApoE修饰的Lipofectamine 2000运载体,DNA包裹实验显示质粒与Lipofectamine 2000和Apo E修饰的Lipofectamine 2000的质量体积比分别为1∶2、1∶2.5时,可完全包裹质粒;Lipofectamine 2000和Apo E修饰的Lipofectamine 2000转染Hep G2细胞的转染效率分别为(20.35±0.50)%、(30.65±0.49)%,ApoE修饰的Lipofectamine2000对Hep G2细胞的转染效率明显高于Lipofectamine 2000,转染效率差异有统计学意义(P=0.001);MTT实验表明Apo E修饰后的Lipofectamine 2000没有增加Lipofectamine 2000对HepG2细胞的毒性作用(P>0.05)。结论通过Apo E对Lipofectamine 2000进行修饰,提高了HepG2细胞对质粒的摄取,成功构建了一种高效的肝癌靶向基因治疗运输载体。