放射诱导启动子的合成与鉴定及质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK的构建

[目的]合成放射诱导启动子序列并构建其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )/ECDglyTK.[方法]利用人工寡核苷酸片段合成放射诱导启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因转染Tca8113细胞,经流式细胞仪鉴定其辐射诱导特性.将pCEA-CDglyTK中双自杀基因CDglyTK亚克隆到pcDNA3.1( ),然后把合成启动子插入到CDglyTK上游构建质粒pcDNA3.1( )/E-CDglyTK并酶切鉴定,阳离子脂质体介导其转染舌鳞癌Tca8113细胞,RT-PCR观察CDglyTK表达及诱导放疗的增效作用.[结果]合成启动子序列分析与设计序列完全一致;低剂量放射线照射可诱导这种人工启动子增强GFP在Tca8113细胞中的表达;重组质粒的酶切图谱与预期一致;3 Gy放疗显著增强CDglyTK在Tca8113细胞中的表达.[结论]成功合成放射诱导启动子并构建由其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )/E-CDglyTK,为进一步研究肿瘤放射-基因治疗奠定了基础.     

pE6/p53/GFP重组真核表达载体的构建及其对肺腺癌细胞周期的影响

目的构建放射诱导启动子序列所调控的wt-p53抑癌基因的真核表达载体pE6-p53／GFP,并研究其功能。方法全基因合成方法获得放射敏感性增强子E6;PCR法从pcDNA3．1（＋）／p53质粒中扩增p53 cDNA全长序列;双酶切IRES2-EGFP双顺反子表达载体,获得IRES2-EGFP报告基因片段,以pCI-neo为载体构建重组pE6／p53／GFP。重组体经双酶切、测序鉴定其正确性。采用脂质体法将重组质粒转染H1299（p53^-/-）细胞,G418筛选出稳定表达细胞株。RT-PCR分析基因整合;Western blot方法分析不同放射剂量后P53蛋白表达情况及持续时间;流式细胞技术分析E6对肺腺癌细胞周期的影响。结果正确构建pE6／p53／GFP重组质粒,并在被转染细胞核内检测到p53基因表达;4Gy照射12h后p53基因表达显著增强;放疗后转染组细胞发生显著G1期阻滞,克隆形成率下降。结论成功构建了放射反应元件E6控导的pE6／p53／GFP重组质粒。     

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究

目的 研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法 PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达栽体pcDNA3．1（-）CMVCDglyTK，XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定，测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株，RT—PcR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC＋GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因，RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段。West—era-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5一FC、GCV、5-FC＋GCV干预下生长受到抑制，5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论 CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

 【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp41基因并构建真核表达我体，进一步为制备自行设计的以λ噬茵体作为栽体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以 克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板，根据Genbank中gp41基因的核苷酸序列设计引物，并在引物的5’端分别引入Kpn Ⅰ及Xho.Ⅰ酶切位点，特异性的扩增gp41基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含gp41编码基因的真核表达栽体，并进行酶切及测序鉴定分析peDNA3、1（＋）／gp41。结果 重组质粒经Kpn Ⅰ，XhoⅠ双酶切成5、4kb与1．0kb的片断，表明表达载体peDNA3、1（＋）中插入了gp41基因片断，测序结果表明编码框正确。结论 成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp41基因的真核表达栽体peDNA3．1（＋）／gp41。     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD／TK融合基因（AdKDR—CDglyTK）对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞，用腺病毒重组体AdEasy-KDR—CDglyTK和AdEasy—CMV—CDglyTK感染之，观察其感染效率并以RT—PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达．然后给予不同浓度的前药5一FC及GCV处理，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT—PCR检测发现：除感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞外．感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株，其表现出对前药不同的敏感性：感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性．且其敏感性差异无显著性意义（P〉0．1）；相比之下，感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感（P〈0．001）。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

人CIDE3基因克隆和真核表达载体构建及促凋亡作用的研究

目的：克隆人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子3（CIDE3）全长基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并检测其促凋亡作用.方法：①提取人腹部皮下白色脂肪组织的总RNA,经RT-PCR获得CIDE3全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并进行序列测定.②用脂质体法将pcDNA3.1（＋）-CIDE3转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果：①经RT-PCR扩增得到特异性717 bp的目的片段,构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3经序列测定,结果与Genbank发表的序列完全一致.②转染Hela细胞后,经Tunel染色法检测发现,转染pcDNA3.1（＋）-CIDE3后有大约25%的细胞发生了凋亡,与转染空质粒pcDNA3.1（＋）（＜5%）及未转染质粒的细胞相比,其凋亡细胞明显增多.结论：成功克隆了人CIDE3全长基因,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并验证了CIDE3基因可诱导细胞发生凋亡的生物学作用,为进一步研究CIDE3的生物学功能奠定了坚实基础.     

电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响

目的 研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子，CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达。方法 利用CMV启动子，EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP,pcDNA3-EGR-GFP重组质粒，经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株，对脂质体转染条件进行优化，在最佳转染条件下，分别给予不同浓度H2O2，不同剂量γ射线处理转染细胞，用荧光显微镜，流式细胞仪（FAC）检测GFP的表达情况。结果 FACS检测显示氧自由基，电离辐射可诱导FGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达。而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达。结论 EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性。     

慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨慢病毒介导的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株（MCF-7）的杀伤作用。方法 构建的重组质粒pLenti6／V5-D-CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6／V5-D-GFP在lipofectamine2000介导下转染293FT细胞,包装、扩增后获得病毒颗粒,体外感染MCF-7细胞株,荧光显微镜下观察阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予前药5-FC,GCV及5-FC＋GCW处理,观察该体系对细胞株的杀伤效应。结果 重组体对细胞株的感染率随慢病毒滴度的增高而递增。RT-PCR方法检测发现MCF-7有目的基因CDglyTK的表达。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。结论 慢病毒为载体有较高的转染效率,MCF-7细胞对前药的具有较高的敏感性,双自杀基因疗效优于任一单自杀基因。     

Aβ1-5多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果

目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗，研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段；在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列；GSGGSG linker再串连两段Aβ1-15二价基因片段，克隆入pcDNA3．1表达载体，构建peDNA3．1-s4xAβ15真核表达质粒；质粒转染COS-7细胞，Western blot检测4xAβ15的表达；质粒肌肉注射接种BALB／c鼠，共6次，18周加强免疫，ELISA法检测抗体效价以及抗体分型；免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合。【结果】测序证实所构建的peDNA3．1-s4xAβ15载体序列正确，在COS-7细胞中表达分子质量约8ku的分泌型4xAβ15蛋白。peDNA3．1-s4xAβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体，随加强免疫次数增多，抗体滴度增加，在19周，抗体平均滴度为1：6400，抗体以IgG1型为主，且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和。【结论】所构建的peDNA3．1-s4xAβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体，为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件。     

人HSP 40基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人热休克蛋白40（HSP40）的2种同源物HDJ-1和HDJ-2基因真核表达载体，观察其在人成神经细胞瘤细胞株（SK-N-SH）中的表达。方法 从流产胚胎脑组织中抽提总RNA，RT-PCR扩增HDJ-1和HDJ-2 cDNA，经限制性内切酶双酶切后，克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）和pEGFP-N1质粒中。HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对，序列正确的重组质粒用脂质体转染SK-N-SH细胞，Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况。结果 HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致。Westernblot证实pcDNA3．1（＋）／HDJ-1转染SK-N-SH细胞24h后有HDJ-1的过表达，至少持续72h；pEGFP-N1／HDJ-1和pEGFP-N1／HDJ-2转染的细胞有HDJ-1／GFP和HDJ-2／GFP融合蛋白的表达，至少持续72h。荧光显微镜观察到pEGFP-N1／HDJ-1和pEGFP-N1／HDJ-2转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论 本实验成功构建pcDNA3．1（＋）／HDJ-1、pEGFP-N1／HDJ-1和pEGFP-N1／HDJ-2真核表达质粒，并在SK-N-SH细胞中表达。     

AFP启动子对绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的影响

目的：研究AFP5‘端3.1kb启动子序列对GFP在人肝癌细胞中表达的影响。方法：首先采用重组DNA技术,构建了由AFP5‘端前导序列（AFP启动子＋AFP EI增强子,3．1kb)调控的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因哺乳动物表达载体pcDNA3-GFP-AFP-w,然后将pcDNA3-GFP-AFP-w、pcDNA3-GFP及空载（pcDNA3-neo)经lipofectin分别转染Bel7402、Hela二种肿瘤细胞,G418抗性筛选得到含各不同质粒的稳定阳性细胞克隆,Western blotting和密度积分扫描检测GFP基因的表达。结果：转染pcDNA3-GFP-AFP-w细胞的GFP表达量在Bel7402中明显高于Hela细胞,在Hela细胞中GFP几乎不表达,但均低于相应转染pcDNA3-GFP的细胞,呈现一定的专一性。结论：AFP5‘端3．1kb启动子序列调控的GFP报告基因载体pcDNA3－GFP－AFP－w对Bel7402肝癌细胞呈现一定的细胞专一性。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）X基因的真核表达载体，为探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系提供实验依据。方法用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对pcDNA3．1（＋）载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并对其进行双酶切和测序鉴定，构建HBVX基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx。用梭华-Sofast^TM基因转染试剂将其质粒转染THP-1巨噬细胞，细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后做Western blotting，鉴定目的蛋白。结果双酶切pcDNA3．1（＋）-HBx后，琼脂糖电泳可分别见到大小约为5．4kb和465bp片断，说明X亚克隆入pcDNA3．1（＋），经序列测定其含有完整的X基因片段；Western blotting结果显示pcDNA3．1（＋）-HBx能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx，并能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。     

反向前列腺特异性膜抗原增强子启动子调控重组质粒的构建及增强子调控活性的比较

目的 探讨前列腺特异性膜抗原（PSMA）启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,了解增强子增强转录效率的能力。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA增强子序列．将其按不同方向亚克隆到含有报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒载体pEGFP—PSMAPPro脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在所转染的细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP—PSMAE-P和pEGFP-PSMAE（r）-P,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的特异有效表达,增强子序列能使基因转录效率提高30倍,不同方向的增强子序列在增强转录效率方面具有同样效应。结论 反向PSMA增强子启动子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性,增强子具有增强启动子转录效率的功能且没有方向性。     

新基因PCIA1真核表达载体的构建及HeLa细胞稳定转染株的建立与鉴定

目的构建人的新基因（PCIA1）的真核表达载体,并将其载体稳定转染到HeLa细胞株中。方法以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）总RNA为模板,通过RT—PCR扩增PCIA1基因编码区eDNA,并将扩增的eDNA片段插入peDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组质粒peDNA—PCIA1,重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将该表达载体导人到HeLa细胞中,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,用RT-PCR和Westernblot检测PCIA1基因在HeLa细胞中的表达。结果经RT—PCR及Westernblot检测,证实真核表达重组质粒peDNA-PCIA1构建成功,PCIA1基因已经稳定转染到了HeLa细胞中并表达PCIA1蛋白。结论成功建立了人新基因PCIA1的稳定转染细胞株,为进一步研究PCIA1的功能奠定了基础。