多重置换扩增(MDA)结合荧光PCR对植入前胚胎进行性别诊断的研究

目的:建立多重置换扩增(MDA)联合荧光PCR对植入前胚胎进行性别诊断的方法,为开展性连锁遗传病的性别筛选提供实验依据。方法:在行IVF-ET助孕的患者中,选取废弃的第3日新鲜或冷冻后的2PN受精胚胎。通过显微操作活检得到单个卵裂球细胞,采用MDA方法对单个/2个卵裂球细胞行全基因组扩增,然后采用荧光PCR方法对AMEL、X22、SRY和XHPRT 4个性染色体相关基因或STR位点进行扩增,对其扩增产物行毛细管电泳检测,分析电泳结果确定植入前胚胎的性别。以父母的外周血单个淋巴细胞作为对照进行分析。结果:①采用蛋白酶K法(n=21)和碱法(n=17)对卵裂球细胞进行裂解行MDA,扩增成功率未见统计学差异(85.7%vs 82.4%,P>0.05);单个卵裂球组(n=15)和2个卵裂球组(n=23)MDA扩增成功率亦未见统计学差异(80.0%vs87.0%,P>0.05)。②利用MDA方法对15个胚胎的单个/2个卵裂球进行扩增,扩增成功率为86.7%(n=13)。13个胚胎中7个为男性,6个为女性,性别检测成功率100%;等位基因脱扣(alleledropout,ADO)发生率为7.7%。结论:PGD中MDA是有效且可靠的全基因组扩增方法,MDA结合荧光PCR可以用于性连锁遗传病的性别筛选、致病基因检测和对胚胎进行HLA分型。     

胚外体腔液中胎儿细胞DNA检测在产前诊断中的应用

目的探讨胚外体腔液中细胞DNA检测用于孕早期诊断性连锁遗传疾病的可行性和准确性。方法对25例孕6～11周、要求人工流产的孕妇术前行胚外体腔穿刺术,抽取胚外体腔液0．5～3ml。采用煮沸法对胚外体腔液进行DNA抽提,Picogreen染料对DNA进行定量分析。采用X,Y两对引物对DNA进行PCR检测。随后行人工流产术,取少量绒毛组织进行染色体核型分析,并与胚外体腔液中的DNA检测结果作对照。结果0．5～3ml胚外体腔液中含有750—6270个胎儿细胞。男性胎儿DNA扩增结果出现两个条带（X,Y）11例,女性胎儿出现1个条带（X）14例。与绒毛组织染色体核型分析结果完全一致。结论胚外体腔液中细胞DNA检测,用于孕早期性连锁遗传疾病的产前诊断具有快速、敏感的特点。     

孕妇血浆中胎儿DNA检测在产前诊断中的应用

目的 探讨孕妇血浆中提取胎儿游离DNA,鉴别胎儿性别以诊断胎儿遗传性疾病的方法。方法 选择妊娠7-38周,B超确诊为单胎,经绒毛和羊水细胞染色体检测,确诊为妊娠男性胎儿的正常孕妇16例,妊娠女性胎儿的正常孕妇8例;X性连锁遗传病（假性肥大性肌营养不良,血友病,色盲,无汗性外胚层发育不良症）家族史行产前诊断者4例,用酚提取法,纯化孕妇血浆中胎儿DNA,然后用巢式聚合酶链反应（PCR）技术测定男性胎儿睾丸决定因子（SRY）。结果 16例妊娠男性胎儿孕妇血浆中,胎儿游离DNA第1次巢式PCR测定,检出SRY基因扩增片段10例,第1次检出率为62.5%;经第2次巢式PCR测定。另6例全部检出SRY基因扩增片段,累计检出率为100%,妊娠女性胎儿的8例孕妇血浆中,均未检出SRY基因扩增片段,4例X性连锁遗传病家族史者均检出SRY基因扩增片段。结论 从孕妇血浆中提取胎儿游离DNA行胎儿性别诊断是一种快速,简便,准确的产前诊断方法。     

Amelogenin基因在产前胎儿性别及伴性遗传病诊断中的价值

目的　探讨Amelogenin基因在产前胎儿性别及伴性遗传病诊断中的价值。 方法　采用Amelogenin基因的一对特异性引物 ,扩增X -Y同源基因。再采用微量薄板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,结合银染 ,检测X与Y同源基因。一次成像记录结果。结果　采用该方法 ,对 2份脐血中男性出现二条带 (X、Y) ,女性出现一条带 (X)。 2 5份绒毛样本 13份出现二条带 ,12份为一条带。 2 5份羊水样本中 10份出现二条带确定为男性胎儿 ,15份出现一条带为女性胎儿 ,与产后随访结果一致 ,符合率 10 0 %。结论　①Amelogenin基因分析技术可用于产前诊断胎儿性别及伴性遗传病的研究 ,并具有科学和实用的优点。②该技术也可广泛用于法医学性别鉴定、运动员性别鉴定及骨髓移植植活诊断等。③同时有X产物做内对照 ,有效防止单扩增Y染色体为基础技术的假阳性和假阴性结果及等位基因丢失现象。     

DNA-DNA原位杂交鉴别早期胚胎的性别

本文作者用~3H-dCTP、dATP、dTTP标记人类Y-染色体特异的DNA探针,通过DNA-DNA原位杂交技术,与从临床体外受精过程中获取的处于分裂期的早期胚胎细胞进行原位杂交,以鉴别早期胚胎的性别。实验结果如:(1)在7个被检的早期胚胎中,有6例Y染色体DNA阳性,从而鉴别为男性;DNA-DNA原位杂交技术对人早期胚胎(从早期分裂阶段到囊胚阶段)Y染色体的鉴别,与其他Y染色体的检测方法所得的结果完全一     

染色体病的植入前诊断

染色体病是一大类遗传病 ,由染色体的数目异常或结构异常所致 ,已发现的染色体病已超过 10 0 0种。现在 ,还没有有效的方法治疗此类疾病。通过羊膜腔穿刺 (ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ,ＡＣ)及绒毛膜取样 (ｃｈｏｒｉｏｎｉｃｖｉｌｌｉｓａｍｐｌｉｎｇ ,ＣＶＳ)技术获取孕中期羊水中胎儿细胞或孕早期绒毛膜滋养细胞 ,以细胞遗传学技术及荧光原位杂交 (ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ,ＦＩＳＨ)技术分析胚胎的染色体组成 ,筛除异常胚胎 ,使正常胚胎继续妊娠 ,有效地减少了染色体病患儿的出生。但是传统的…     

简并寡核苷酸引物聚合酶链反应扩增单细胞全基因组均匀性研究

目的　探讨单细胞简并寡核苷酸引物聚合酶链反应 (DOP PCR)扩增全基因组DNA的均匀性及植入前胚胎遗传学研究的新途径。方法　获取正常男女性、X单体、X、13和 2 1三体细胞 ,行单细胞DOP PCR ,通过比较基因组杂交 (CGH )双色荧光强度比变化 ,分析扩增均匀性。结果　 (1)DOP PCR产物 /正常男性基因组DNACGH :约 1/ 3常染色质区强度比均数及标准差超过正常允许范围 ,X染色体假性过度表达 ,13、2 1三体无明显变化。 (2 )DOP PCR产物 /正常男性单细胞DOP PCR产物CGH :94%强度比均数及标准差接近期望值 ,能显示正常男女性、X单体、X、13和 2 1三体染色体拷贝数变化。结论　单细胞DOP PCR扩增基因组DNA存在明显的不均匀性 ,但这种不均匀扩增是非随机的。如选择合适的参照 ,扩增产物可用于植入前胚胎等单细胞全基因组研究。     

X-连锁脊柱骨骺发育不良家系孕早期产前诊断一例

2007年本实验室对1例X-连锁脊柱骨骺发育不良家系(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,X-SEDL)进行基因诊断[1],确诊该家系的先证者(图1:I:1)为位于染色体Xp22.2的SEDL基因的4号外显子c.209G＞A突变致病,其女儿(图1:Ⅱ:1)为该致病基因突变携带者(c.209G/A杂合突变).2008年,该女性携带者于妊娠19周时曾在本院对胎儿(图1:Ⅲ:1)采集的羊水细胞进行基因诊断,证实为男性胎儿伴遗传突变基因而引产.此次妊娠11周时要求在孕早期对胎儿(图1:Ⅲ:2)进行产前诊断.签署手术知情同意书后,行绒毛膜穿刺术取绒毛组织.部分绒毛组织标本经常规细胞培养、收获制片后G显带染色体核型分析.部分绒毛组织提取基因组DNA,进行Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome,SRY)检测,判断性别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件参照文献[2].参照相关研究[1]直接PCR扩增SEDL基因4号外显子,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后进行DNA序列分析.同时选择Xp22区域内位于SEDL基因附近的4个短串联重复(shorttandemrepeat,STR)位点(包括DXYS10085、DXYS10092、DXYS10093和DXYS233)进行PCR扩增检测,PCR扩增引物及反应条件见参考文献[3],进行单体型分析.     

分子生物学技术在植入前诊断中的应用

植入前诊断是产前诊断非常早的一种方法，目的是放弃携带严重遗传病的胚胎，将健康胚胎植入母体。两种主要的方法是聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交（FISH）。PCR用于单基因病诊断，FISH用于染色体异常诊断。临床主要应用于存在遗传风险的患者如携带单基因病和染色体易位的患者。随着分子生物学技术的飞速发展，如比较基因组（CGH），全基因组扩增技术（WGA），引物延伸预扩增（PEP），间期核转换技术及DNA芯片技术（DNAchip）等PGD先进检测手段的应用，单细胞用于诊断单基因或多基因突变及染色体疾病，为期不远。     

遗传病产前基因诊断的方法与进展

本文介绍遗传病产前基因诊断的新进展,包括①有遗传病发病风险的胎儿DNA的四种来源:羊水细胞、胎盘绒毛、孕妇外周血、植入前胚胎囊胚或其细胞;②遗传病产前基因诊断的主要方法:寡核苷酸探针法、联锁分析法、限制性内切酶片段长度多态性、突变位点直接分析法及多取酶链反应法。     

孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断中的应用

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,寻找一种无创性产前基因诊断的新方法。方法提取42例孕14~40周的产妇血浆中游离胎儿DNA,采用引物延伸预扩增(primerextensionpreamplification,PEP)后行PCR,特异性扩增其Y染色体重复序列(DYZ3)基因。同时采用9个短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)多态性位点的多重扩增方法以检出血浆中胎儿DNA。结果DYZ3-PCR中,32例妊娠男性胎儿孕妇中有28例血浆中出现基因扩增带,检出率为87.5%,10例妊娠女性胎儿孕妇血浆有2例假阳性结果。性别总符合率为85.7%,STR-PCR中,检测出孕妇血浆中父源性胎儿DNA的存在。结论应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断敏感性和特异性较高,是一种无创性产前基因诊断方法,具有广泛的临床应用前景。     

人类ZFY基因巢式PCR技术的建立及产前诊断的初步研究

目的：建立一种对性连锁遗传病胎儿进行产前性别诊断的方法及探讨利用孕妇外周血中胎儿细胞检测ＺＦＹ基因的可行性。方法：用计算机辅助设计的两对寡核苷酸引物位于染色体ＺＦＹ基因保守区内，并建立了巢式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）技术扩增男性特异性的ＺＦＹ基因。结果：扩增产物分别为３５４ｂｐ和３０７ｂｐ，对不同标本的扩增结果表明，该引物具有高度的敏感性和特异性，２０份男性标本中均发现特异扩增片段，但在２０份女性标本中均未发现。应用该引物对３１份孕妇外周血连续监测，胎儿ＺＦＹ基因检出率随孕周增加而增高，总准确率达９６８％（３０／３１），４５份绒毛标本的阴性／阳性之比为１：１１４３，接近实际的胎儿性别比。结论：用巢式ＰＣＲ技术检测ＺＦＹ基因具有特异、敏感、快速、准确的优点，提示该法检测胎儿细胞ＤＮＡ是可行的，在临床上可用于性连锁遗传病的产前性别诊断。     

自然流产患者绒毛与复发性流产患者胚胎植入前遗传学筛查微阵列比较基因组杂交结果对比分析

目的:探讨植入前遗传学筛查(PGS)降低复发性流产(RSA)患者早期流产率的可能原因及临床意义。方法:通过微阵列比较基因组杂交(aCGH)检测,统计自然流产(SA)患者绒毛染色体非整倍性异常高发核型,分析该高发核型在RSA患者胚胎中的发生几率。结果:SA患者绒毛中16、X、15号3条染色体的非整倍性占绒毛染色体非整倍性异常的52.27%;在RSA患者胚胎中,该3条染色体非整倍性占胚胎染色体非整倍性异常的50.50%。结论:SA患者绒毛染色体异常类型相对集中,具有明显的高发核型;RSA患者胚胎染色体非整倍性高发核型与流产绒毛相一致,提示对RSA患者行PGS助孕,可规避染色体异常胚胎的着床,从而降低早期流产率。     

应用Amelogenin基因进行胎儿和两性畸形病人性别判定的研究

目的 检测X-Y-染色体的特异片断Amelogenin基因为进行孕早、中、晚期胎儿性别和两性畸形病人的性别判定提供了一个准确快速的可靠方法。方法1997年8月至2000年2月哈尔滨医科大学第二医院应用PCR技术对58例孕妇(其中孕早期绒毛30例，孕中期羊水14例，孕晚期脐带血14例)和3例两性畸形病人外周血提取DNA进行X-Y-Amelogenin染色体特异片段检测。结果 男性呈现977bpX和788bpY染色体特异片段，女性呈现977bpX特异片段。DNA扩增片段长度差为189bp。胎儿的产前诊断和临床性别判定结果与染色体核型分析，病理报告，临床性别表型一致。结论 通过检测．Amelogenin基因进行胎儿性别产前诊断是可靠的。     

Amelogenin基因在产前胎儿性别及伴性遗传病诊断中 …

目的 探讨Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ基因在产前胎儿性别及伴性遗传病诊断中的价值。方法 采用Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ基因的一对特异性引物,扩增Ｘ－Ｙ同源基因。再采用微量薄板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,结合银染,检测Ｘ与Ｙ同源基因。一次成像记录结果。结果 采用该方法,对２份脐血中男性出现二条带（Ｘ、Ｙ）,女性出现一条带（Ｘ）。２５份绒毛样本１３份出现二条带,１２份为一条带。２５份羊水样本中１０份出现二条带确定为男性     

对遗传病高危孕妇行早期经腹绒毛取样

经腹绒毛取样可以替代经宫颈的途径进行遗传病的产前诊断。时间可由孕极早期到孕13周以后。本文研究了于孕9周前对遗传病高危孕妇行经腹绒毛取样的可行性。 在产科门诊选择200例有遗传病危险并希望得到产前诊断的孕妇。其中2例妊娠有患假肥大性肌营养不良的危险,198例有患β-地中海贫血的危险。在超声波指引下,将20-22号穿刺针以平行或轻度倾斜的方式进入丛密绒毛膜,每次取样进针不超过两次。取样后数小时孕妇即可出院,出院前须再作超声检查以确定胎儿情况,并除外绒毛膜内和绒毛膜后血肿。将绒毛DNA行聚合酶链反应得到基因扩增后,经斑点印迹分析直接检测β-地中海贫血的基因突变。用多重外显子扩增法,对一例已有一个患假肥大性肌营养不良症小孩的孕妇诊断出一个患病     

植入前遗传学诊断四例临床分析

目的 探讨对遗传病高危夫妇采用单细胞荧光原位杂交（FISH）进行胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的临床价值。方法 对曾生育过遗传病患儿的4对夫妇通过超排卵获得卵子,体外受精,体外培养至6-8细胞胚胎,每个胚胎取1-2个细胞,采用FISH进行遗传学分析。筛选无遗传病发病风险的胚胎移植入子宫。结果 4例患者共进行4个治疗周期,获得可供活检的胚胎12个,活检细胞20个,固定后有核细胞17个,FISH后除2个细胞无杂交信号外,其余杂交信号清楚,结果明确,活检后的12个胚胎继续发育,结合遗传学诊断,8个胚胎可供移植,其中1例妊娠,于2001年9月14日足月剖宫产分娩一女婴,发育正常,体重4270g,出生后染色体检查为正常女性核型。结论 对遗传病高危夫妇采用FISH技术进行PGD具有临床应用价值。     

自然流产绒毛染色体核型分析的研究现状

自然流产的发病率日趋升高,其主要原因为染色体异常,分析胚胎染色体的核型对寻找自然流产的原因具有重要意义。绒毛细胞染色体制片的培养法成功率高于直接法,但培养法的操作难度及成本亦高于直接法;自然流产的绒毛染色体异常核型中以非整倍体的发生最多见,其中16三体约占三体的1/3;自然流产、辅助妊娠后流产的绒毛染色体异常率分别都高于人工流产的绒毛染色体异常率;对于自然流产绒毛染色体异常与支原体、衣原体感染相关性及自然流产次数、年龄、孕周及胚胎性别与绒毛染色体核型的关系均尚无明确结论。目前类似以上通过绒毛染色体分析寻找自然流产原因的研究很多,但可以治疗的原因并不多见,故还需结合临床的实验指标,寻找与绒毛染色体的相关性,进一步提高染色体分析的意义。     

46,XY单纯性腺发育不全女性(Swyer综合 征)中睾丸决定因子SRY的存在

在男性个体中,从胚胎生殖嵴分化成睾丸是由位于 Y-染色体上的一种名为睾丸决定因子的基因引发的,此因子可能活化一系列常染色体基因,通过苗勒氏管抑制因子和睾酮的作用形成睾丸。将睾丸决定因子定位于 Y-染色体短臂上是基于对性转换个体的研究。Page 等通过对带有 Yp 末端片段的X X 男性及发生 Y-常染色体易位缺失染色体短臂末端片段的女性1例研究,从 Y 染色体上分离出一个140Kb 的片段命名为 ZFY 的基因,初步定为睾丸决定因子。然而其后发现在3例 X X 男性和1     

人类SRY基因用于产前诊断的初步研究

目的：建立一种对性连锁遗传病胎儿进行产前性别诊断的方法。方法：采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增男性特异的ＳＲＹ基因，扩增片段大小为４２２ｂｐ。结果：对不同标本的扩增表明，１０例男性标本中均出现该特异扩增片段，而女性无此片段；２０例羊水标本的扩增结果与其新生儿实际性别完全一致；４７例绒毛标本中２２例阳性，阴性／阳性之比为１∶１．１３６，接近实际的胎儿性别之比。同时进行了全血和羊水的直接ＰＣＲ，在４μｌ至０．５μｌ血时可出现扩增带，羊水在２ｍｌ至０．５ｍｌ时也出现扩增带。结论：ＰＣＲ特异扩增ＳＲＹ基因片段，在临床上可用于性连锁遗传病的产前性别诊断