鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

拉米夫定--部分调节HepG2.2.15细胞干扰素诱导基因表达

为了解抗病毒核苷类似物拉米夫定（3TC）处理的Hep2．2．15细胞干扰素（IFN）抗病毒基因表达谱以及3TC对IFN信号转导途径的影响而开展此项研究。具体方法：将培养的Hep2．2．15细胞用3TC处理，再以IFN-α刺激6h，分离细胞总RNA，经逆转录、^32P标记后与尼龙膜上的探针基因芯片进行分子杂交——Macroamy法，并以此来分析3TC处理的Hep2．2．15细胞IFN抗病毒基因表达谱。用ELISA、Dotblot、Southernblot分析3TC处理的Hep2．2．15细胞分泌HBV抗原、     

preS2反义RNA肝癌特异性表达载体的构建及相关特性研究

目的 构建针对preS2基因的肝癌特异性反义RNA表达载体，并对其特异性和有效性进行研究。方法 PCR扩增preS2(3203—340)基因，克隆至含甲胎蛋白启动子的EB病毒表达载体pEBAF，构建反义RNA表达载体pEBAF-as—preS2。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，3d后Northern blot检测preS2 mRNA的表达，ELISA检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果序列分析表明，pEBAF-as-preS2构建成功，Northern blot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达，pEBAF-as-preS2转染3d后，可显著抑制HepG2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别为33．4％和41．5％；对HBV复制抑制率为86％。结论 反义RNA表达载体pEBAF-as-preS2仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

人Epsilon干扰素在CHO细胞中的表达及生物学活性的研究

目的 为了研究新发现的人epsilon干扰素（hIFN-ε）的生物学活性，我们通过RT-PCR克隆了hIFN-ε基因，并构建pcDNA3．1／myc-his（-）A-hIFN-ε（以下简称pcDNA3-1A-hIFN-ε）的真核表达载体，在CHO细胞中表达，并研究真核细胞重组表达的rhIFN-ε的生物学活性。方法 用TNF-α刺激人宫颈癌HeLa细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc-his（-）A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε并在CHO细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物中的rhIFN-ε对多种病毒的抗病毒活性；MTT法检测其对A375、HeLa和A549细胞的生长影响，并通过在Wish、HeLa、A375细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究hIFN-ε的抗病毒机制。结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序，结果表明已经成功构建了重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε，并在CHO细胞中稳定表达了rhIFN-ε蛋白，该蛋白具有抗HSV-I、PolioV、Ad3和VSV病毒的作用，能够抑制HeLa、A375、A549细胞的生长，刺激Wish、HeLa、A375细胞产生MxA蛋白。结论 本研究成功地构建了pcDNA3．1A-hIFN-ε真核表达载体并在CHO细胞中获得稳定表达，证明了ddFN．￡蛋白具有抗病毒和抗增殖活性，其抗病毒效应的分子机理可能与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白有关，为今后研究rhIFN-ε的生物学功能和基因重组药物研制及其开展基因治疗奠定了基础。     

细胞内La表达对乙肝病毒复制的影响研究

目的：研究细胞内La的表达对HBV病毒复制的影响。方法：针对人La蛋白序列设计并合成特异性的SiR—NA，转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，实时荧光定量PCR测定HepG2．2．15细胞中La mRNA变化水平及HBV DNA复制水平。结果：特异性SiRNA干扰La蛋白的mRNA表达，使La在HepG2．2．15细胞中的表达降低；HepG2.2．15细胞分泌在培养上清液中的HBV DNA水平显著下降，相关性分析结果显示，HBV DNA变化水平与La mRNA变化水平呈正相关。结论：细胞内La可以保护HBV RNA免受核酸酶的破坏、促进HBV病毒复制。     

慢性乙型肝炎基因治疗研究进展

随着分子生物学尤其是基因工程技术的发展，抗乙型肝炎基因治疗已有了广泛而深入的研究。利用基因重组、反义核酸等技术在细胞甚至分子水平上的研究表明，基因治疗在抗乙肝病毒（HBV），抑制病毒复制等方面有着很好的作用。本文将着重对近年来抗乙肝病毒治疗基因的筛选以及外源治疗基因的载体投递系统方面的研究进展进行综述。     

小发卡RNA抗呼吸道合胞病毒效应的研究

目的 为从基因水平抑制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的复制，针对RSV的M2-2基因构建小发卡结构状RNA（short hairpin RNA，shRNA）重组质粒，在细胞水平观察shRNA对RSV复制的影响。方法 将成功构建的针对RSV M2-2基因的重组质粒pshRNA8260转染HEp-2细胞，利用光镜观察pshRNA8260对RSV致HEp-2细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）的影响并计算CPE抑制率，空斑形成实验检测RSV滴度变化。结果 成功构建了针对人RSV M2-2基因mRNA的pshRNA8260重组质粒，研究发现pshRNA8260能明显改善RSV所致的病变效应，降低RSV在细胞内复制的病毒滴度。结论 针对RSV M2-2基因的pshRNA82（g）重组质粒具有明显的特异性抗RSV效应的作用。     

天然免疫分子APOBEC3G蛋白的抗HBV研究进展

天然免疫分子APOBEC3G蛋白酶是一种胞苷脱氨酶,是机体固有免疫反应的新成员,参与宿主抵抗病毒入侵的天然免疫防御机制,具有较强的广谱抗逆转录病毒能力。APOBEC3G抗逆转录病毒的作用机制研究已成为机体固有免疫研究新靶点,为机体固有免疫机制的研究开拓了新的方向。由于APOBEC3G可能在基因超突变、病毒脱衣壳、HBV RNA的逆转录、HBV DNA复制、HBV DNA核壳化等多方面影响HBV复制,所以研究APOBEC3G的抗病毒作用是治疗HBV感染的研究重点,也有可能对其他病毒性疾病的防治提供新的线索并产生重要的影响。     

重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达

目的 探索利用逆转录病毒载体表达HBV载体的可能性及复制缺损性HBV能否被正确包装。方法 在逆转录病毒载体中插入表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元，制备重组逆转录病毒后分别用以感染Hep G2和2．2．15细胞，免疫荧光法检测细胞内HBV核心抗原的表达，PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果 在包装细胞系PA317中能形成较高滴度的重组逆转录病毒，用以感染Hep G2细胞后，可检出核心抗原的表达。感染2．2．15细胞后，在培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 重组逆转录病毒能携带HBV载体在细胞内表达，并在有野生型HBV提供结构蛋白的前提下，发挥HBV载体的功能，可望用于抗HBV基因治疗。     

HBV基因型芯片检测方法的研究

HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组经反转录过程进行复制。由于反转录酶缺乏自我校读功能，且感染过程中，在宿主免疫反应的抗病毒压力或特异性治疗的作用下，病毒基因组发生变化，造成HBV核苷酸序列的显著差别。HBV基因分为A～H 8个基因型，能更好的刻画病毒致病性的不同。基因芯片技术的出现，对于像HBV这样高变异性病原体的基因分型检测无疑是一大改进。     

患者顺应性对干扰素治疗慢性丙型肝炎疗效影响的研究

目的 探讨慢性丙型肝炎患者顺应性对IFN抗HCV治疗效果的影响。方法 对聚乙二醇干扰素α-2a单药和与联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎的疗效与安全性的开放、多中心对照研究中患者的干扰素治疗进行回顾性研究。以持续病毒学应答作为疗效的主要评价指标，分析患者顺应性对IFN疗效的影响。结果 190例患者用IFN治疗，其中未完成全部治疗而脱落的病例为63例，脱落率为33．20％。完成12周治疗的179例患者中，102例（56．98％）取得早期病毒学应答。127例完成了整个疗程，79例取得持续病毒应答，PP人群的持续病毒应答率为62．2％，11Tr人群的病毒持续应答率为23．68％，两者之间差异具有统计学意义（x^2=152．5，P〈0．0001）。结论 患者顺应性对慢性丙型肝炎IFN治疗效果的影响较大。     

C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

MxA蛋白研究进展

MxA蛋白是Ⅰ型干扰素（α／β）诱导产生的分布于细胞质中的蛋白质，具有广谱的抗病毒活性，对粘液病毒、副粘液病毒、布尼亚病毒、棒状病毒、囊膜（外衣）病毒、小RNA病毒及乙肝病毒均有敏感的抗病毒活性。本文论述了MxA蛋白的结构和抗病毒机制的最新研究进展，以及MxA蛋白表达与肾综合症出血热、红斑狼疮等疾病的发生、发展之间的关系，并揭示了MxA基因的单核苷酸多态性在慢性肝炎患者对干扰素治疗反应性的机制中起重要作用，并可做为一个可靠的预测因子。     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

慢性乙型肝炎基因治疗研究进展

随着分子生物学尤其是基因工程技术的发展,抗乙型肝炎基因治疗已有了广泛而深入的研究。利用基因重组、反义核酸等技术在细胞甚至分子水平上的研究表明,基因治疗在抗乙肝病毒(HBV),抑制病毒复制等方面有着很好的作用。本文将着重对近年来抗乙肝病毒治疗基因的筛选以及外源治疗基因的载体投递系统方面的研究进展进行综述。     

急慢性乙型肝炎患者的抗-HBc亲和力

HBcAg 可出现在乙型肝炎患者血中,是一种血清学标志,可代表病毒持续复制。已有报道证实针对HBcAg 的细胞免疫应答在乙型肝炎发病机理中起重要作用;如用从肝细胞中分离出来的或基因重组的HBcAg分子免疫黑猩猩,将会使动物产生抵抗HBV感染的能力,HBcAg 还可增加小鼠B 细胞对HBsAg 的应答能力。HBV 感染时患者体内有抗-HBc,这种抗体对疾病转归有重要作用。作者选择9例慢性乙型肝炎患者,7例无症状乙型肝炎病毒携带者进行研究(均可检出HBSAg 和抗-HBc),利用基因重组型     

短双链RNA对柯萨奇B组3型病毒体外感染的抑制作用研究

目的利用RNA干扰技术，在细胞、蛋白和基因水平上观察短双链RNA对柯萨奇病毒体外感染Hela细胞的增殖抑制作用、对病毒RNA复制和蛋白合成的影响。方法应用病毒致细胞病变作用保护实验、空斑形成减少实验、Western Blot、RT-PCR等方法，在体外检测其抗CVB3病毒作用。结果设计、合成的8条SiRNA中，针对基因组2B、VP4、2A、3C区的SiRNA-2、SiRNA-3、SiRNA-6、SiRNA-7具有不同程度的抑制病毒作用。其中，病毒基因组2B的SiRN．2作用效果最好，对Hela细胞CVB3感染72h后致细胞病变和空斑形成的抑制率为95％，抑制病毒蛋白的合成，病毒基因的复制水平也显著降低，在病毒0．1、0．01、0．001、0．0001 MOI感染水平上对CVB3致细胞病变作用的抑制率分别为30％、70％、88％和99％（48h）。结论针对CVB3基因组2B的SiRNA-2具有较强的抑制柯萨奇B3型病毒感染的作用。     

TRAIL诱导乙型肝炎病毒转染细胞株凋亡的实验研究

目的 探讨人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）对HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2．2．15的凋亡诱导效果。方法应用MTT法了解TRAIL对HepG2．2．15细胞的诱导效果，琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术和Caspase．3酶活性分析TRAIL诱导HepG2．2．15细胞凋亡过程。结果TRAIL（0．1μg／mL）作用于HepG2．2．15细胞株12、24、36h后，细胞抑制率分别为17．91％、41．26％、59．85％；PI单染亚二倍体含量12h后为21．8％，高于对照组的8．7％；24h后DNA电泳200bp处出现特异性条带；6h后Caspase-3酶活性为对照组的4．76倍。结论TRAIL诱导后，HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2．2．15发生凋亡     

以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系

目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。     

SARS冠状病毒全基因组cDNA芯片的研制以及人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制分子机制的初步研究

目的 在细胞水平上，利用研制的SARS病毒全基因组芯片技术探讨人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制的分子机制。方法 根据已经发表的SARS病毒基因组全序列和生物信息学软件分析，设计包括SABS病毒全基因组的各个可能编码区的PCR引物；将所有PCR产物用来制备SABS病毒的全基因组cDNA芯片。利用该芯片来探讨人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制的分子基础。结果 通过：PCR方法研制了SARS病毒全基因组的cDNA芯片，并说明cDNA芯片可以准确地检测SARS病毒各个基因的RNA水平。利用这一技术研究了于扰素抗SARS病毒的分子机制。结果表明，人重组干扰素α2b可以明显抑制SARS病毒复制过程中几乎所有病毒RNAs的转录，并呈现一定的剂量关系；并发现一个目前还没有确定功能的SARS病毒新基因，命名为U基因，转录最早，转录水平最高，对干扰素的抑制作用也很敏感；它可能在病毒的转录复制过程中发挥重要作用。结论 SARS冠状病毒cDNA芯片可以用来研究病毒复制的分子机制以及相关抗病毒药物包括干扰素的研究。本文在分子水平上研究了人于扰素α2b抑制SARS病毒复制的基因转录动态，并就干扰素α2b抑制SARS病毒的可能分子机制及其潜在的应用价值进行了讨论。