人信号素基因semaphorin-3F瞬时转染对舌鳞癌细胞增殖作用的影响

目的探讨人信号素家族中最具代表性成员信号素3F（semaphorin-3F，SEMA-3F）基因瞬时转染对舌鳞状细胞癌细胞生长的影响。方法将Tea8113细胞分为4组，即转染组：转染pEGFP-N1-SEMA-3F-cDNA的Tca8113细胞；空载体组：转染pEGFP-N1质粒的Tca8113细胞；未转染组：无转染细胞；对照组：仅加转染试剂。构建和纯化SEMA-3F的真核表达载体pEGFP-N1-SEMA-3F，用阳离子脂质体转染试剂介导转染Tca8113细胞。观察外源目的基因在靶细胞中的表达及细胞的生长情况。结果基因转染后48h成功检测到高表达SEMA-3F基因。转染后24、48、72、96h，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测转染组的各时期平均A值，均低于其余3组。转染后48h，流式细胞仪检测G1期细胞比例降低，S期比例增高。结论SEMA-3F基因瞬时转染可使其在Tca8113细胞中高表达，并使细胞增殖受到抑制。本实验结果将SEMA-3F作为目的基因，为治疗舌癌进一步提供了实验依据。     

Semaphorin3F基因转染舌鳞状细胞癌细胞的方法研究

目的：探讨阳离子脂质体介导转染舌癌细胞的可行性，筛选含有Semaphorin3F（SEMA3F）的舌鳞状细胞癌细胞，检测SEMA3F基因在舌癌细胞中的表达。方法：应用阳离子脂质体转染方法将SEMA3F导入Tca8113细胞中，G418筛选阳性克隆，用RT—PCR检测转染组细胞中SEMA3F基因的表达。结果：Tea8113细胞中SEMA3F基因表达下调。筛选14d后，含有SEMA3F的转染组细胞克隆形成，SEMA3F在转染组细胞中表达稳定。结论：阳离子脂质体介导转染的外源性基因SEMA3F在Tea8113细胞获得稳定表达，为进一步实验奠定了基础。     

p27kip1基因转染与化疗药联合应用对舌癌细胞生长的影响

目的探讨人p27^kip1基因转染与化疗药联合应用对舌癌细胞生长的影响。方法从正常组织中克隆人p27^kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上，应用脂质体将重组质粒转染舌癌Tca8113细胞，观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达，以及转染与未转染细胞加用化疗药物后的生长情况。结果成功克隆p27^kip1 cDNA并构建p27^kip1真核表达载体，将其导入Tca8113细胞中，经G418筛选得到稳定表达p27^kip1基因的细胞株，转染p27^kip1基因的细胞显示了对化疗药长春新碱的敏感性增高。结论p27^kip1基因转染提高了化疗药对舌癌Tca8113细胞生长抑制作用。     

人肿瘤坏死因子-α基因转染人胚成肌细胞的表达和分泌研究

目的　应用人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因转染人胚成肌细胞,观察转染hTNF-α基因后人胚成肌细胞表 达和分泌hTNF-α的水平。方法　用阳离子脂质体DOSPER介导含hTNF-α基因的穿梭质粒pSV23SHTNF转染人胚 成肌细胞;对照组只给予等量的脂质体,不加入质粒。转染基因后24、48、72、96 h用免疫组织化学染色观察hTNF-α 基因在人胚成肌细胞细胞浆和细胞膜的表达水平,并用ELISA法检测人胚成肌细胞培养上清液中hTNF-α的浓度。 结果　免疫组织化学染色发现实验组人胚成肌细胞在转染hTNF-α基因后24、48、72、96 h均见细胞浆和细胞膜hT- NF-α呈强阳性表达,而对照组均呈弱阳性;ELISA检测发现实验组人胚成肌细胞培养上清液中hTNF-α平均浓度在 各时期均高于对照组(P<0.05),尤以转染72 h后最高,达401.0 pg/ml。结论　hTNF-α基因转染成肌细胞,可使成 肌细胞持续高表达和高浓度分泌hTNF-α,提示可以用hTNF-α基因转染舌癌周围肌细胞,使癌周微环境肌细胞持续 表达和分泌高浓度hTNF-α来抑制舌癌向肌深层浸润。     

人肿瘤坏死因子-α基因转染与干扰素-γ联合应用对舌癌细胞生长的影响

目的:探讨干扰素-γ( IFN-γ) 与人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α) 基因转染联合应用对舌癌细胞生长的影响。方法:将培养细胞分为2 组,其中一组转染hTNF-α基因,另一组不转染;再将每一组又分为5 个小组,每一小组分别加入IFN-γ,使其终浓度分别为0、1、10、100、1000 U/ ml ,培养48 h 后,用MTT法测定Tca8113 细胞的存活率,用免疫细胞化学染色法观察hTNF-α的表达。结果:单纯加入IFN-γ对舌癌细胞的活性无影响;hTNF-α基因转染与IFN-γ联合应用时,不同浓度的IFN-γ均有协同hTNF-α基因转染杀伤舌癌细胞的作用,而且其抑瘤效应与IFN-γ的浓度呈正相关( r = 01867 , P < 0101) ;与未转染组相比,转染组细胞hTNF-α呈明显的高表达。结论:联合应用IFN-γ能增强hTNF-基因转染对Tca8113 舌癌细胞的抑制作用。     

反义hTR对舌鳞癌细胞系Tca8113作用的初步探讨

目的：观察反义hTR对人舌鳞癌细胞系Tca8113的影响及其与细胞周期和凋亡的关系。方法：脂质体介导真核表达载体PBBS212－hTR转染Tca8113细胞系，运用流式细胞仪技术观察细胞周期的改变和凋亡，并结合免疫组化和原位杂交技术分析转染前后某些基因表达的变化，结果：转染反义hTR的Tca8113细胞克隆生长减缓，群体倍增时间较未转染和转染空质粒组明显延长，流式细胞仪显示转染细胞PI指数下降，有亚二倍体凋亡峰出现，转染后细胞p21基因表达水平显著增高，裸鼠移植瘤实验显示转染后的Tca8113致瘤性减弱，结论：反义hTR可引起细胞通过细胞周期关卡受阻而显著抑制Tca8113细胞的生长，同时激活了某些凋亡程序而导致细胞凋亡，端粒酶可能是肿瘤基因治疗的理想靶点。     

两种转染方法介导质粒转染人舌鳞癌细胞的实验研究

目的:比较新型阳离子聚合物交联化聚乙烯亚胺(polyethylenimine-ethyleneglycol dimethacrylate,PEI-EGDMA)与阳离子脂质体TRANSfection转染人舌鳞癌(Tca8113)细胞的转染效率和细胞毒性.方法:将合成的含有绿色荧光蛋白报告基因的靶向血管内皮生长因子RNA干扰质粒,分别通过PEI-EGDMA和TRANSfection转染入Tca8113细胞中,每组设4 种浓度.转染后24 h,荧光显微镜下观察转染效果,计算各组的转染效率.48 h后四甲基偶氮唑盐(MTT)法行细胞毒性检测.结果:PEI-EGDMA与重组质粒质量比(W∶ W)控制在1.5∶ 1时转染效率最高,约为72%,与其余浓度组相比存在显著性差异(P<0.05).TRANSfection与重组质粒质量比控制在2∶ 1时,转染效率最高,约为55%,与其余各浓度组有显著性差异(P<0.05).在各自最佳转染条件下,PEI-EGDMA的转染效率明显提高.MTT结果显示在实验设定的浓度范围内,各组细胞的生长无显著性差异(P>0.05),细胞毒性较小.结论:新型阳离子聚合物PEI-EGDMA与TRANSfection相比转染效率更高,细胞毒性小,有望成为人舌鳞癌细胞基因转染的有效载体.     

转染反义细胞周期蛋白A的舌癌细胞系的建立与鉴定

目的:研究反义细胞周期蛋白(cyclin A)基因对舌癌细胞周期的调控作用,为cyclin A在基因治疗方面提供理论基础。方法:采用阳离子脂质体转染方法将已构建成功含人全长cyclinA(1177 kb)的反义真核表达载体pAS-A导入舌癌细胞系(Tca8113),经G418选择性培养液筛选,获得阳性克隆细胞,通过细胞原位杂交检测cyclin A基因的稳定转染情况。结果:pAS-A成功转染进入Tca8113,转染后细胞内cyclin A mRNA的转录和蛋白表达明显降低。结论:反义cyclin A基因稳定有效的在Tca8113细胞系中表达。     

转染反义细胞周期蛋白A的舌癌细胞系的建立与鉴定

目的 :研究反义细胞周期蛋白 (cyclinA)基因对舌癌细胞周期的调控作用 ,为cyclinA在基因治疗方面提供理论基础。方法 :采用阳离子脂质体转染方法将已构建成功含人全长cyclinA(1 77kb)的反义真核表达载体pAS_A导入舌癌细胞系 (Tca8113) ,经G418选择性培养液筛选 ,获得阳性克隆细胞 ,通过细胞原位杂交检测cyclinA基因的稳定转染情况。结果 :pAS_A成功转染进入Tca8113,转染后细胞内cyclinAmRNA的转录和蛋白表达明显降低。结论 :反义cyclinA基因稳定有效的在Tca8113细胞系中表达     

转染BMP-II型突变受体基因对Tca8113舌癌细胞增殖的影响

目的：明确转染BMP-Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用，以进一步探讨BMPs对口腔上皮恶变的作用机制。方法：用FuGENll6(Transfection Reagent Kit)真核转染试剂盒将携带BMP-Ⅱ型突变受体cDNA的真核表达载体转染Tca8113细胞(命名为Tca8113ZR细胞)；然后对Tca8113ZR和Tca8113细胞分别进行生长曲线、MTT检测，FCM分析，BrdU标记检测细胞的增殖活性及DNA合成；以观察转染前后舌癌细胞生物学性状的变化。结果：Tca8113ZR细胞和Tca8113细胞相比，形态未见明显变化，但是细胞的增殖活力明显下降。结论：BMPs信号表达水平的改变在口腔上皮组织的恶变过程中起着十分重要的调控作用。     

靶向siRNA干扰hTERT联合顺铂抑制Tca8113增殖的实验研究

目的：应用hTERT特异性siRNA干扰舌癌Tca8113细胞hTERT基因的表达,探讨hTERT-siRNA联合顺铂对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法：体外化学合成针对hTERT的siRNA,通过阳离子脂质体将siRNA-hTERT1转染舌癌Tca8113细胞,RT-PCR检测hTERTmRNA表达水平,Western印迹检测其蛋白表达水平,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）及流式细胞分析法分别测定hTERT-siRNA联合顺铂处理后对舌癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响。数据采用SPSS13.0进行方差分析。结果：靶向hTERT的siRNA可以有效抑制舌癌Tca8113细胞株hTERT的表达,hTERT-siRNA和顺铂均可抑制Tca8113细胞增殖并诱导其一定程度的凋亡。当联合应用靶向hTERT的siRNA和顺铂时,上述作用显著加强（P〈0.05）。结论：体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效抑制舌癌Tca8113细胞hTERT的表达,hTERT表达受抑制后,可增强顺铂作用舌癌Tca8113细胞的敏感性。     

脂质体介导hES基因转染人舌鳞癌Tca8113细胞及其蛋白表达

目的　建立转人内皮抑素(hES)基因舌鳞癌Tca8113细胞,检测体外培养的转基因细胞基因蛋白表达。方法　为了建立携带hES基因的舌鳞癌Tca8113细胞克隆,选用阳离子脂质体Lipofectamin为载体,将含hES基因的质粒---pBLAST-hES转染Tca8113细胞,以Blasticidin S抗生素筛选阳性克隆。免疫组织化学S-P方法检测体外培养的转基因Tca8113细胞克隆中ES的表达。结果　经Blasticidin S抗生素筛选,转染hES基因的Tca8113细胞由于具有 bsr抗性基因,可以在含有50μg/ml Blasticidin S的培养基中生长和传代,从而得到携带hES基因的Tca8113细胞克隆。该细胞在体外培养传代96 h后,经免疫组织化学检测,hES表达的强阳性(+++)率为100%。结论　以脂质体介导hES基因转染Tca8113细胞效率高,转基因细胞具有高效表达活性目的基因产物的能力。     

Fas基因转染对舌鳞癌细胞系Tca8113凋亡的影响

目的探讨外源性Fas基因介导舌鳞癌细胞凋亡的可行性及其可能的分子机制。方法脂质体法将重组人Fas真核表达载体转染人舌鳞癌细胞系Tca8113，抗Fas单克隆抗体诱导其凋亡，Western blotting检测转染前后Tca8113细胞Fas蛋白表达水平，TUNEL法检测转染前后细胞凋亡水平。结果转染后Tca8113细胞Fas蛋白表达上调；抗Fas单克隆抗体可诱导Tca8113细胞凋亡，凋亡指数升高。结论上调Fas基因表达及应用抗Fas单克隆抗体可诱导肿瘤细胞凋亡，有可能作为肿瘤基因治疗的新途径。     

诱导型一氧化氮合酶基因转染对人舌癌细胞体内致瘤力的影响

目的研究外源性基因诱导型一氧化氮合酶(iNOS)转染人舌癌细胞系Tca8113后,对肿瘤细胞生物学特性以及裸鼠体内致瘤力的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pCMV-iNOS/Tca转染入舌癌细胞系Tca8113,得到高表达iNOS的细胞系pCMV-iNOS/Tca,转染空白质粒的细胞系pCMV-Tca,并以Western blot方法鉴定转染效果。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色绘制生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期分布;通过裸鼠成瘤实验,比较转染前后体内成瘤能力的差别。结果与未转染组和转染空白载体组比较,pCMV-iNOS/Tca组的细胞生长速度比Tca组快(P>0.05),细胞周期中G2/M和S期比例增加(P<0.05)。体内成瘤能力试验结果显示,pCMV-Tca、pCMV-iNOS/Tca组和Tca组平均瘤重分别为(1.1±0.24)g、(2.5±0.48)g和(1.3±0.32)g,pCMV-iNOS/Tca组的成瘤力高于pCMV-Tca和Tca组(P<0.01)。结论转染iNOS基因后,Tca8113细胞具有更强的体外增殖能力和体内致瘤能力。     

p27kip1基因转染及其对人舌癌细胞增殖的影响

目的:探讨人p27kip1基因对人舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响。方法:从正常组织中克隆人p27kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上,应用脂质体将重组质粒转染舌癌Tca8113细胞,观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达、细胞的生长情况及细胞周期的变化。结果:成功克隆p27kip1cDNA并构建真核表达载体,将其导入Tca8113细胞中,经G418筛选得到稳定表达p27kip1基因的细胞株,其细胞的生长受到抑制,增殖下降。G0/G1期细胞百分数由34.973%增至66.064%,细胞出现了凋亡。结论:克隆并在体外转染Tca8113细胞获得了p27kip1的高表达,抑制舌癌细胞由G1期向S期过渡从而抑制了细胞增殖。     

RNA干扰FAT10基因对舌癌细胞系Tca8113增殖和侵袭的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中FAT10基因的表达,探讨FAT10基因表达下调对舌癌细胞生物学行为的影响。方法:构建针对FAT10基因特异性siRNA真核表达载体pU-FAT10-siRNA,将其转染至舌癌细胞株Tca8113,采用RT-PCR、Western印迹等方法检测转染后的Tca8113细胞中FAT10的表达。通过流式细胞仪分析siRNA对舌癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的影响。结果:siRNA干扰Tca8113细胞后,FAT10的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降(P<0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论:通过RNAi技术阻断FAT10的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、迁徙,提示FAT10基因在舌癌的发生发展过程中起重要作用。     

骨形态发生蛋白-2基因转染对舌癌细胞增殖活性的影响

分别以感染复数(MOI)为0、50、100的腺病毒为载体的BMP-2基因转染体外培养的舌癌Tca8113细胞。采用荧光倒置显微镜观察转染前后Tca8113细胞形态的变化,Western blot法检测Tca8113细胞BMP-2的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Tca8113细胞增殖能力,并绘制生长曲线。结果:MOI为100时转染率最高,转染前后Tca8113细胞形态变化不大,Western blot检测到Tca8113细胞BMP-2的表达,转染后Tca8113细胞的增殖活性降低。结论:腺病毒介导的人BMP-2在体外能够抑制舌癌Tca8113细胞的增殖活性。     

放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞及其耐药细胞株耐药性的影响

目的：探讨舌鳞癌Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113/CBDEA细胞对放疗的敏感性及放疗对其耐药性的影响.方法：应用MTT法测定Tca 8113和Tca 8113/CBDEA细胞的放疗成活曲线,实时定量逆转录PCR（real-time quantitative PCR,RT-PCR）检测放疗对多药耐药基因1（mdr1）、多药耐药相关蛋白1基因（mrp1 ）和谷胱甘肽硫-转移酶π基因（gst-π）表达的影响和对细胞内阿霉素浓度的影响.结果：Tca 8113/CBDEA对放疗的ID50是Tca 8113的1.24 倍（P＜0.01）.Tca 8113/CBDEA细胞在放疗后4 h mdr1,mrp1,gst-π耐药基因表达无明显上升,24 h耐药基因的表达明显升高（P＜0.01）,Tca 8113细胞的耐药基因表达在4 h和24 h时均有明显上升（P＜0.01）.放疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显下降.结论：耐药的舌鳞癌细胞表现放疗耐受性,放疗可引起舌鳞癌细胞的耐药.对舌癌患者进行放疗和化疗的方案设计时应考虑此点.     

Survivin基因在顺铂诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡中的作用

目的体外观察顺铂（DDP）诱导Tca8113舌鳞癌细胞株凋亡的作用, 同时检测在此过程中凋亡蛋白抑制因子Survivin mRNA表达和蛋白表达的变化。方法将人Tca8113舌鳞癌细胞株进行传代培养,MTT法检测顺铂不同浓度和不同时间对Tca8113舌鳞癌细胞生长的抑制作用,通过RT- PCR检测凋亡过程中Survivin基因mRNA的表达,免疫细胞化学观察Survivin基因的蛋白表达,以及流式细胞术观察顺铂诱导各组Tca8113细胞的凋亡率。结果顺铂可明显抑制Tca8113舌鳞癌细胞的增殖, 其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性,细胞凋亡率也呈同样的趋势,最高可达34.1%。1.0 μg/mL DDP处理Tca8113舌鳞癌细胞,Survivin mRNA和蛋白表达水平随时间的增加而降低,在24h达到最低,随后又升高。结论抗凋亡蛋白Survivin在Tca8113舌鳞癌细胞高表达,顺铂可有效诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡, Survivin mRNA表达在化疗早期随作用时间的延长而降低,Survivin基因的抑制在顺铂诱导的Tca8113舌鳞癌细胞的细胞凋亡中起着重要的作用。     

PD184352对舌鳞状细胞癌细胞增殖及ERK蛋白表达的影响

目的:体外观察PD184352对人舌癌细胞Tca8113细胞增殖及ERK蛋白表达的影响。方法:采用MTT比色试验法观察PD184352对Tca8113细胞增殖的影响,免疫细胞化学观察ERK蛋白的表达。结果:随着PD184352作用浓度和作用时间的增加,其对舌癌细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05)。当100μmol/L的PD184352刺激Tca8113细胞72h后,对舌鳞状细胞癌细胞抑制率达到69.2%。加入PD184352后ERK蛋白在舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113中表达降低(P<0.05),随着浓度的增加而更为明显。结论:体外PD184352对Tca8113细胞增殖有抑制作用,该作用可能与及抑制ERK蛋白表达有关。