中国北方汉族骨髓供者HLA-B＊15组基因多态性的PCR-SBT分型研究

为了研究中国北方汉族骨髓供者HLA—B＊15等位基因的分布特征，探讨其可能对临床供体选择的影响，从中华骨髓库陕西分库内随机抽取815名已知低分辨分型结果中国北方汉族骨髓供者，采用聚合酶链反应-碱基序列直接测序（PCR—SBT）方法对其中206例HLA—B＊15阳性样本和另外附加17例样本进行HLA—B位点DNA测序分析，并应用同源模建分子模拟技术对所有结果模拟出三维结构，用计算机软件Swiss—PdbViewer比较模拟结构间的差异大小。结果表明：随机抽取的815例样本HIJA—A、B、DRB1基因分布符合Hardy—Weinberg平衡定律，HIJA—B＊15基因频率为0．1379，总共检出16种HIJA—B＊15等位基因，分属7种血清学特异性，以B＊1501、B＊1511、B＊1502和B＊1518为主，频率分别为0．0485、0．0215、0．0178和0．0160，累计频率构成比占全部B＊15的75．11％，其余12种B＊15等位基因频率均〈0．0100。19例HIJA—B＊15，-测序分析表明，其中10例中低分辨水平上的纯合子中仅4例为真正意义上的B＊15xx，-纯合子，且均由各自优势基因构成。三维结构模拟分析发现同一血清型中既存在结构差异微小的等位基因，如B＊1501、1505、1507、1525、1527、1532（RMSD≤0．02nm），也存在差异较大的等位基因，如B＊1502、1511、1521之间以及B＊1503、1546之间（RMSD均为0．29nm），而一些分属不同血清型的等位基因之间结构却近似（RMSD值≤0．02nm）。结论：本研究应用PCR—SBT，首次取得了中国北方汉族样本量最大的高分辨水平HLA—B＊15基因多态性分布特征，这将有助于临床患者寻找合适供者，并为移植免疫及本地区群体遗传学等方面的研究提供了重要依据，且对于临床选择最适供者，像HLA—B＊15这样血清学特异性及基因亚型高度多态性的家族进行准确的高分辨分型是必要的。     

应用中高分辨率分型方法分析中国人群HLA-B15组的多态性

目的　了解人类白细胞抗原(HLA)系统中最常见、最复杂且最难分型的B15组的多态性情况，并探讨其是否影响移植时供的选择。方法　对194名随机健康人群用反向PCR—SSO方法做HLA—AB分型，同时，对部分样品作HLA—AB血清学分型，以期得到与等位基因对应的血清学特异性。结果　本研究共得到7种属于B15组的等位基因，包含了4种血清学特异性。在中国人群HLA—B15组中，B^*1501占绝大多数，B^*1502，B^*15ll，B^*1518，B^*1527的分布频率相似。结论 B^*1527较常见，其与B^*1501(两均为B62)在供受间错配、是否能导致移植物抗宿主反应(GVHD)等方面，需要作进一步的研究。结果提示在移植时对于HLA—B15组如仅做低分辨率分型是不够的。     

PCR—SBT法HLA基因分型模棱两可结果的判读及解决对策

目的研究PCR—SBT法HLA基因分型结果判读中出现的模棱两可问题并提出解决策略。方法对306名随机抽取的组织配型患者的DNA采用PCR-序列特异性引物（Sequence Specific Primer,SSP）低分辨方法检测,同时采用PCR—SBT法进行HLA—A,B,DRB1高分辨基因分型。PCR—SBT法模棱两可结果用PCR—SSP高分辨方法复核确认。结果所有306例检测标本的高低分辨血清学抗原一致,经PCR—SBT基因测序方法检测有111份模棱两可结果,占36．3％（111／306）。其中HLA—A座位有30对等位基因存在模棱两可结果,占所有检测标本等位基因总数的3．3％;HLA—B座位有66对,占7．2％;HLA—DRB1座位有36对,占3．9％。所有模棱两可标本经PCR—SSP HLA基因高分辨分型试剂PCR—SSP等方法复核确认。结论针对PCR—SBT法进行HLA—A,B,DRB1高分辨基因分型模棱两可结果所建立的解决策略,对于提高HLA数据分型的速度和分型准确性有重要意义。     

供、患者HLA-A、B、DRB1高分辨分型的无关供者外周血造血干细胞移植32例回顾分析

目的探讨供、患者的人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因高分辨相合及亚型相合,无关供者外周血造血干细胞移植后效果的情况,为临床造血干细胞移植治疗选择适配供者提供理论依据。方法采用PCR-SSP或SBT技术对供、患者HLA-A、B、DRB1的基因进行高分辨分型,定期随访患者在造血干细胞移植后状况,统计分析移植后效果。结果32例患者与供者的HLA低分辨分型结果完全相合,HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型全相合的患者与HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型不相合的患者,造血干细胞植活和两年半内的移植存活率比较,无统计学差异。结论HLA低分辨分型结果完全相合是临床医生选择造血干细胞移植的重要条件之一,供、患者HLA-A、B、DRB1高分辨分型是外周血造血干细胞移植治疗前组织配型不可少的实验之一,但HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型错配对无关供者外周血造血干细胞移植的造血干细胞植活和两年半内的移植存活率影响较小,HLA基因高分辨分型可以帮助临床医生选择合适的供者。     

3238名江苏汉族造血干细胞捐献者HLA-A、B、DRB1位点高分辨基因分型结果的研究

目的 分析中国江苏地区汉族人群造血干细胞捐献志愿者的HLA-A、B、DRB1位点在高分辨基因分型水平上的基因多态性弹倍型分布特征以及常见与罕见等位基因的分布.方法 大量应用基因序列分型技术和少量应用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针技术对中华造血干细胞捐献志愿者资料库江苏分库3238名无关供者的HLA-A、B、DRB1位点等位基因作高分辨分型.结果 HLA-A基因46个,HLA-B基因85个,HLA-DRB1基因51个.HLA-A位点频率最高的是A*11∶01(16.52％),HLA-B位点为B*13∶ 02(11.60％),HLA-DRB1位点为DRBl* 07∶01( 15.78％).单倍型频率最高是A* 30∶ 01-B* 13∶02-DRBl* 07∶01 (8.87％).HLA-A位点常见等位基因(CWD)种类有40种,在样本中的含量达到99.8％,HLA-B位点CWD则有77种(99.5％),HLA-DRB1位点的CWD有47种(99.8％),并发现少量在中国人群未报道的罕见基因.结论 本资料从高分辨水平反映了江苏地区汉族人群HLA的分布状况.对指导临床寻找HLA匹配的无关造血干细胞供者,HLA与疾病相关研究和我国人群群体遗传学研究等有重要意义.     

慢性粒细胞性白血病与HLA等位基因多态性的相关性

目的探讨慢性粒细胞性白血病（CML）的易感性与HLA等位基因多态性的相关性。方法采用聚合酶链反应序列特异性引物（PCR—SSP）分型技术对46例CML患者进行HLA—A、B、DRB1基因分型，并与7418例健康对照的分型结果进行对比。结果CML患者HLA—A^＊30、B^＊45、B^＊81、DRB1^＊09基因频率较对照组升高（P〈0．05），HLA—A^＊03、DRB1^＊12、DRB1^＊13基因频率降低（P〈0．05），差异有显著性。结论HLA—A^＊30、B^＊45、B^＊81、DRB1^＊09等位基因与CML相关，HLA—A^＊03、DRB1^＊12、DRB1^＊13可能具有保护作用。     

中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨等位基因频率分析

目的分析中华骨髓库造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1 5位点在高分辨基因分型水平上的等位基因频率特征。方法根据718名中华骨髓库捐献者HLA5位点高分辨分型数据,运用直接计数法计算各位点基因频率。结果在718名捐献志愿者中,共检出28个HLA-A等位基因、61个HLA-B等位基因、30个HLA-C等位基因、40个HLA-DRB1等位基因、18个HLA-DQB1等位基因;其中HLA-A位点最常见等位基因为A*1101(21.66%)、A*2402(16.37%)、A*0201(13.79%);HLA-B位点最常见等位基因为B*4001(11.49%)、B*4601(9.54%);HLA-C位点最常见等位基因为Cw*0702(15.74%)、Cw*0102(15.32%)、Cw*0304(11.56%);HLA-DRB1位点最常见等位基因为DRB1*0901(14.69%)、DRB1*1501(12.40%)、DRB1*0701(9.89%);HLA-DQB1位点最常见等位基因为DQB1*0301(20.54%)、DQB1*0303(15.81%)、DQB1*0601(10.79%)。结论本研究在高分辨基因分型水平提供了一套有关中国人群HLA-A,-B,-C,-DRB1和-DQB1 5位点基因频率数据。     

山东鲁西地区汉族人群HLA—A、B、DRB1座位高分辨等位基因多态性分析

目的了解山东鲁西地区汉族人群HLA—A、B、DRB1座位高分辩水平的基因多态性特点。方法采用PCR—SBT对647例山东鲁西地区汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA—A、B、DRB1座位高分辨分型,直接计数法计算各等位基因频率。结果本研究共检出HLA—A、B、DRB1等位基因139种,其中,常见基因为HLA—A＊02：01（0．097372）、A＊11：01（0．165379）、A＊24：02（0．156105）;HLA—B＊13：02（0．084235）、B＊51：01（0．072643）、B＊40：01（0．065688）;HLA—DRB1＊15：01（0．139104）、DRB1＊07：01（0．138331）、DRB1＊09：01（0．125966）。结论山东鲁西地区汉族人群HLA—A、B、DRB1座位高分辨水平等位基因表现为高度多态性特点,常见基因的种类和频率分布与中国北方汉族近似,与中国南方汉族存在明显差异。     

HLA测序技术在非亲缘性脐血移植应用价值探讨

1998年6月至2004年7月，广州脐血库向国内21家移植中心54例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了探讨非亲缘性脐血移植供／受者HLA等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系，对54例非亲缘性脐血移植病例中，半年后有反馈随访资料的48例，利用盐析或柱提法提取移植的非亲缘性脐血的DNA及移植病例的全血DNA，采用HLA—SBT方法分别对HLA—A、B、DRB1位点进行了高分辨分型，并与我库脐血收集常规采用的HLA—SSP（HLA—Sequencing specific primers）低分辨结果进行了比较分析。结果发现，HLA不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD的发生率具有统计学显著性差异（P〈0．05）。在对HLA—A、B、DRB1等位基因高分辨单因素分型结果中，HLA—B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD发生率显著低于不完全相合病例GVHD的发生率（P=0．000，P=0．005）。结论：PCR—SBT技术在非亲缘性脐血移植HLA配型方面具有重要的临床应用价值。     

HLA-Cw位点低分辨基因分型"纯合子"的等位基因特性研究

目的 研究HLA-Cw位点低分辨基因分型"纯合子"的等位基因特性,为临床移植配型提供精确资料.方法 在43例血缘关系造血干细胞移植(HSCT)供受者中,对中国最常见的低分辨基因分型Cw*03和Cw*07的"纯合子"个体采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)高分辨基因分型方法 进行等位基因定型,并采用自主研制的三维结构匹配软件系统(HLA StrucMark version1.0)对其等位基因产物进行三维结构匹配,以预测不同分辨率分型结果 对移植物抗宿主病(GVHD)发生的影响.结果 低分辨基因分型Cw*03、Cw*07"纯合子"个体的高分辨基因分型结果 显示Cw*03及Cw*07的纯合子分别为14%和43%,其余均为Cw*03及Cw*07杂合子个体.可见其低分辨基因分型易造成供受者问等位基因的错配;在有家系校正的情况下,标本的低分辨模糊结果 可以通过家系遗传分析来校正定型;在无家系校正的情况下,应通过高分辨基因分型来确定等位基因,三维结构差异分析则显示这些错配有可能造成HSCT后GVHD的发生.结论 当低分辨基因分型结果 只出现Cw位点"纯合子"时,有家系的标本应当以家系分型结果 校正定型,无家系校正的标本应当用高分辨基因分型方法 进行核实,从而为临床移植提供准确的配型报告,以防止无关供-受者HSCT后因等位基因错配而引起的严重GVHD.     

四川骨髓库汉族人群HLA-B~* 15等位基因分布

目的采用聚合酶链反应-序列分析基础上的HLA分型(polymerase chain reaction-sequence based typ-ing,PCR-SBT)方法,研究中国造血干细胞捐献者资料库(以下简称为中华骨髓库,CMDP)四川分库中四川籍汉族人群HLA-B*15组等位基因的分布特点。方法从四川骨髓分库中汉族人群中/低分辨分型HLA-B*15阳性样本中按不同血清学特异性分层抽取107例样本,应用PCR-SBT技术进行测序分型,获得四川籍汉族人群B*15组高分辨分型结果。应用方根法计算HLA-B*15各等位基因频率,同时与其他人群资料进行比较。结果共检测到16种已知HLA-B*15等位基因和1例未知等位基因。本研究中检出的16种等位基因有:B*15010101(B62),B*1502(B75),B*1503(B72),B*1505(B62),B*1507(B62),B*151101(B75),B*1512(B76),B*1513(B77),B*1517(B63),B*1518(B71),B*1525(B62),B*1527(B62),B*1529(B15),B*1532(B62),B*1546(B72),B*1558(B62)。其中以B*1502(36.2%)最常见,其次为B*15010101(21.6%),B*151101(9.5%),B*1518(6.9%),B*1525(6.0%),这5种等位基因占B*15等位基因家族的80%。在B*15等位基因家族中,表达B75抗原的等位基因B*1502和B*151101共占45.7%,但表达B62抗原的B*15等位基因多态性最强,共检出7种等位基因。此外,本研究发现1例未知等位基因,该等基因序列与目前所有已知的B*15或B*46等位基因序列均不相同,在外显子3的116位处存在1个点突变C->T。结论研究表明在四川籍汉族人群中HLA-B*15等位基因水平表现出丰富的多态性和特有的分布特征。     

HLA-B新等位基因B*3936的确认和测序分析

本研究确认HLA新等位基因HLA—B％3936并分析其序列。先证者为脐血造血干细胞捐献者，样本DNA抽提采用PEL—FREEZ抽提试剂盒，利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLA—B基因的第2—4外显子，对PCR产物直接进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果显示：先证者样本中存在2个HLA—B等位基因，其中1个等位基因为HLA—B％4002，另1个经Blast验证确定为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ242650，DQ24265l，DQ242652）。与最接近的B％3901等位基因比较，新的等位基因在第3外显子上有4个核苷酸的差异，其中第527位T→A、第538位C→T、第539位T→G、第544位A→G，这引起氨基酸第152位缬氨酸（Val）→谷氨酸（Glu）、第156位异壳氨酸（Ile）→色氨酸（Trp）、第158位苏氨酸（Thr）→丙氨酸（Ala）。实验结果提示该等位基因为新的HLA-B等位基因，已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA—B％3936。     

广东汉族人群HLA-B~* 15等位基因分布

目的了解广东献血者汉族人群HLA-B*15等位基因的多态性。方法从1 691名广东汉族献血者中采用中/低分辨分型获得带有HLA-B*15基因型466例样本,进一步应用PCR-SBT技术进行测序分型,获得广东汉族人群B*15高分辨分型结果。应用PyPop软件计算HLA-B*15各等位基因频率,同时与其他人群资料进行比较。结果共检测到16种已知HLA-B*15等位基因,其中以B*15∶02(64.75%)最常见,其次为B*15∶01(13.26%),B*15∶25(4.554%),B*15∶27(4.158%),B*15∶12(3.960%),这5种等位基因占B*15等位基因家族的90.69%。在B*15等位基因家族中,表达B75抗原的等位基因B*15∶02、B*15∶11和B*15∶21共占67.92%,但表达B62抗原的B*15等位基因多态性最强,共检出6种等位基因。结论广东汉族人群中HLA-B*15等位基因表现出高度的多态性及其特有的分布特征。     

广西地区汉族人群HLA-B15和HLA-B40组抗原多态性研究

目的研究广西地区汉族人群HLA-B15和HLA-B40组抗原的等位基因和特异性的分布情况,探讨其可能对临床供者选择的影响。方法采用多聚酶链式反应-基于测序的分型技术(PCR-SBT)对广西地区1 644名汉族人进行HLA-B基因分型,采用直接计算法计算每个等位基因的频率,分析各等位基因的抗原特异性,将HLA-B15和HLA-B40组的基因频率和与其他人群比较。结果 1 644名广西地区汉族人HLA-B位点基因频率不符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P0.05)。HLA-B15组共检出14个等位基因,分属5种抗原特异性;HLA-B40组共检出6个等位基因,分属2种抗原特异性。结论广西地区汉族人群HLA-B15和HLA-B40组抗原多态性比较接近中国南方汉族人群,但也有广西地区特点。     

中国南方汉族人群中卡马西平导致SJS/TEN与HLA-B基因的相关性

目的:探讨中国南方汉族人群中卡马西平(CBZ)所致Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症(SJS/TEN)与HLA-B基因的相关性。方法:采用病例对照研究,收集11例CBZ-SJS/TEN患者(CBZ-SJS/TEN组)、93例CBZ耐受患者(CBZ耐受组)及93例未服用抗癫痫药物的正常人(正常对照组)。PCR和测序法检测其HLA-B*1502基因型;χ2检验分析HLA-B*1502及其他HLA-B位点与CBZ-SJS/TEN的相关性。结果:CBZ-SJS/TEN组的HLA-B*1502基因阳性率为72.7%,显著高于CBZ耐受组及正常对照组。3例HLA-B*1502阴性CBZ-SJS/TEN患者的基因型分别为HLA-B*1511/1511、5401/5401及4001/4601。除HLA-B*1502之外,HLA-B*1511基因频率在CBZ-SJS/TEN患者与中国南方汉族正常人群之间具有显著的统计学差异,其他位点差异均无显著性。结论:在我国南方汉族人群中HLA-B*1502与CBZ-SJS/TEN具有相关性,建议汉族人群在服用CBZ前应该进行基因型检测。同时,对HLA-B*1502阴性个体使用CBZ治疗时,需密切监视,避免SJS/TEN的出现。     

115例汉族骨髓供者HLA-Cw位点基因多态性的研究

目的调查汉族骨髓供者中常见的HLA-Cw等位基因.方法对115例骨髓捐献者采用PCR-SSP方法进行HLA-Cw低分辨和高分辨分型.结果 115例汉族骨髓捐献者中,HLA-Cw位点基因频率分布由高至低依次为Cw*03(0.259 8)、Cw*01(0.214 2)、Cw*07(0.197 8)、Cw*08(0.115 4)、Cw*12(0.058 2)、Cw*14(0.039 9)、Cw*15(0.039 9)、Cw*06(0.039 9)、Cw*04(0.030 9);进一步检测到16种等位基因,其中Cw*010 1、Cw*030 4、Cw*030 2、Cw*040 1、Cw*060 2、Cw*070 2、Cw*080 1、Cw*120 2、Cw*140 2、Cw*150 5、Cw*150 2为对应抗原最为常见的等位基因.结论本研究在DNA水平上,提供了中国汉族人群中HLA-Cw位点基因分布频率及常见等位基因资料.     

基因组序列分析HLA新等位基因B*3818内含子和外显子同时突变

目的 分析HLA新等位基因B*3818的基因组序列.方法 克隆测序方法 对PCRSBT中发现的1个未知HLA-B等位基因的基因组序列进行双向全长测序,并采用微量淋巴细胞毒方法 鉴定该等位基因编码分子的抗原特异性,通过群体调查和家系分析了解该等位基因的群体分布频率和单倍型组成情况.结果 新等位基因HLA-B*3818(序列注册号为FJ561482)与B*380201在第4外显子和第5内含子同时存在1个核苷酸的差异.第4外显子的第660位碱基由C变为A,导致第196个密码子由GAC变为GAA,相应氨基酸由天门冬氨酸变为谷氨酸,与IMGT/HLA中的HLA-B等位基因的序列进行对比,该突变为新的单核苷酸多态性位点.第5内含子的第2133位碱基由A变为C,除此之外,B*3818的内含子序列与B*380101、B*380201和B*3814相同.该新HLA等位基因的血清学特异性为B38,其在中国汉族人群中的分布频率小于0.000 5,家系调查结果 表明携带该新等位基因的单倍型为A*030101-CW*010201-B*3818-DRB1-1312-DQB1*060101.结论 新等位基因HLA-B*3818的内含子和外显子同时存在变异,研究新等位基因的基因组序列可为HLA基因相关研究和应用提供更多的序列信息.     

HLA-B无效等位基因B*5408N的核苷酸序列分析

本研究探讨HLA新的等位基因HLA-B＊5408N的分子基础。采用商用抽提试剂盒抽提样本DNA,利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第2-4外显子,对PCR扩增产物直接进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果表明：先证者样本测序得到两个等位基因,其中一个等位基因为HLA-B＊1527,另一个经blast验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank（DQ295998,DQ295999,DQ296000）。与最接近的HLA-B＊5401等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第553位G→T,这导致第161位氨基酸Glu（GAG）→终止密码（TAG）,蛋白质的翻译提前终止。血清学方法未能检出HLA-B54抗原。结论：该等位基因为HLA-B无效表达等位基因,已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B＊5408N。     

HLA-B~*27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性研究

目的比较强直性脊柱炎患者与中华骨髓库福建人群中HLA-B*27基因携带者HLA-B*27基因亚型的分布差异;探讨HLA-B*27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性。方法中华骨髓库中HLA-B*27基因携带者(阳性对照组)采用PCR-SSO方法检出,强直性脊柱炎患者(AS组)HLA-B*27基因采用低分辨PCR-SSP方法检出;2组HLA-B*27基因亚型均采用高分辨PCR-SSP方法检测。结果阳性对照组130名HLA-B*27基因携带者中,共检出B*2703、B*2704、B*2705、B*2706、B*2707、B*2711、B*27207种基因亚型;在强直性脊柱炎患者中共检出B*2704、B*2705、B*2707、B*2711、B*27155种基因亚型。两组HLA-B*27基因亚型的频率的差异无显著性意义(P>0.05)。结论HLA-B*27基因健康携带者与强直性脊柱炎患者HLA-B*27基因亚型的总体分布未见显著性差异。