棘霉素对K562细胞生长及相关激酶的影响

目的研究棘霉素对人白血病细胞K562生长及相关激酶的影响。方法取对数生长期的K562细胞,采用0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L棘霉素分别处理24h,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术观察细胞周期分布,Western blot检测Bcr-Abl、AKT的表达。结果棘霉素对K562细胞的IC50为0.82μg/L。随着浓度的增加,棘霉素对酪氨酸激酶的抑制作用增强;棘霉素在2.0μg/L时,其抑制细胞蛋白激酶B的磷酸化程度最高。结论棘霉素可以抑制K562细胞的增殖,其机制与抑制酪氨酸激酶和下调蛋白激酶B的作用有关。     

优势表达SphK-1基因对K562细胞生物学特性的影响

目的:了解优势表达鞘氨醇激酶-1(SphK-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞生物学特性的影响。方法:使用pLXSN、pLXSN-SphK-1的重组逆转录病毒液感染K562细胞并用终浓度1 000 ng/m l的G418筛选感染pLXSN和pLXSN-SphK-1基因的K562细胞;取对数生长期的K562-pLXSN和K562-SphK细胞提取蛋白收集胞浆蛋白,应用BCA-200蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。根据蛋白定量取蛋白含量相同的蛋白提取上清行γ3-2P-ATP掺入法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞SphK-1活性;并应用MTT法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞的增殖情况及对不同剂量格列卫的敏感性。结果:K562细胞转染SphK-1基因比转染空载体后的细胞SphK-1酶活性显著增高;K562-pLXSN细胞和K562-SphK细胞培养24 h、48和72 h后细胞增殖无显著性差异;当格列卫浓度为0.1和0.25μmol/L时,K562-PLXSN和K562-SphK细胞培养72 h后的细胞存活率无明显差异;当格列卫浓度为0.5至10μmol/L时,K562-SphK细胞存活率显著低于K562-PLXSN细胞(P<0.05)。结论:优势表达SphK-1基因对K562细胞自然增殖无显著影响,但增加了细胞对浓度高于0.5μmol/L格列卫的敏感性。     

伊马替尼敏感及耐药K562细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子和鞘氨醇激酶表达的比较

目的:比较伊马替尼敏感及耐药K562(K562/Ima)细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶表达的差异。方法:取对数生长期的K562和K562/Ima细胞,采用不同质量浓度的伊马替尼分别处理48h,应用MTT法计算耐药倍数;另取上述2种细胞,分别采用Western blot、RT-PCR及同位素掺入等方法检测2种细胞中P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶的表达。结果:相对于K562细胞,K562/Ima细胞的耐药倍数为24。在K562/Ima细胞中,P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶的表达均高于K562细胞。结论:K562/Ima的耐药机制与P-糖蛋白、缺氧诱导因子、鞘氨醇激酶等基因的表达上调有关。     

棘霉素对KBV200细胞作用的初步研究

目的初步研究棘霉素(echinomycin)对KBV200细胞(耐长春新碱的口腔癌细胞)的作用及其作用机制。方法采用MTT法及流式细胞仪分别检测KBV200细胞的增殖和凋亡;用同位素掺入、Western blot、RT-PCR等方法分别检测鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达。结果棘霉素可诱导KBV200细胞的凋亡,流式结果出现DNA亚二倍体凋亡峰;棘霉素对鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达有不同程度的抑制作用。结论棘霉素对KBV200细胞有细胞毒作用,其作用机制与抑制鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达有关。     

体外诱导K562细胞伊马替尼耐药及其机理的初步探讨

目的 体外诱导K562细胞伊马替尼(imatinib)耐药并对其耐药性进行检测.方法 以浓度递增的方法诱导K562对伊马替尼产生耐药, MTT法确定其耐药性.RT-PCR方法半定量测定耐药细胞中BCR/ABL基因水平,并进行BCR/ABL基因序列测定.流式细胞术测定P-gp表达.高效液相色谱仪(HPLC)测定耐药细胞内药物浓度.结论 ①浓度递增法成功诱导K562细胞伊马替尼耐药(K562R),K562R细胞能长期在含5.0 μmol/L的伊马替尼的培养液中生长.②细胞生长曲线显示5.0 μmol/L伊马替尼作用于K562R细胞120 h,其活细胞数量与0 h无明显差别.6个浓度梯度的伊马替尼(0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.00 μmol/L)作用于K562细胞24 h,发现所有浓度(除0 μmol/L外)伊马替尼均可抑制K562细胞的生长,24 h细胞活力几乎为零.③MTT法抑制率测定K562细胞半数抑制浓度约为0.75 μmol/L,K562R细胞约为7.5 μmol/L,耐药倍数约为10倍.④HPLC细胞内药物浓度测定显示K562R胞内伊马替尼药物浓度低于K562细胞(P＜0.01),流式细胞检测未发现P-gp表达.⑤374 bp的BCR/ABL基因序列分析未发现常规热点区域基因突变.结论 体外成功诱导出伊马替尼耐药细胞--K562R细胞.K562R耐药主要环节为胞内药物浓度降低,而胞内药物浓度降低与P-gp无关.耐药机理需要进一步研究.     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398下调K562/ADM细胞MDR1/P-gp表达

目的 探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对白血病多药耐药K562/ADM细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法 以细胞K562/ADM为NS-398作用的靶细胞,MTT法检测细胞增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因(MDRl)mRNA的表达;流式细胞仪(FCM)测定P-gp蛋白表达水平.结果 NS-398显著抑制K562/ADM细胞增殖,呈时间、剂量正相关效应;下调K562/ADM细胞MDRl基因表达并抑制P-gp合成,呈明显的剂量依赖关系.结论 COX-2抑制剂NS-398可在一定时间和剂量范围抑制白血病多药耐药K562/ADM细胞MDRl/P-gp表达,并能抑制K562/ADM多药耐药细胞增值.     

STAT5-ROS信号通路介导K562细胞伊马替尼耐药的机制研究

目的 探讨信号转导与转录因子5-氧化物(STAT5-ROS)细胞信号转导通路在慢性髓细胞白血病细胞(K562)伊马替尼(IM)耐药中的作用机制.方法 以浓度递增的方法诱导K562对IM产生耐药, CCK-8法检测其耐药性.RT-PCR方法定量测定K562/G细胞中STAT5A和STAT5B mRNA表达.流式细胞术测定ROS和细胞凋亡水平.Western blot法检测细胞中总STAT5和p-STAT5蛋白表达.结果 实验成功诱导K562/G耐药细胞,CCK-8法测定耐药倍数为80倍.细胞生长曲线显示20 μmol/L IM作用于K562/G细胞48 h,活细胞数量减半.0.1 μmol/L IM作用于K562细胞24 h,活细胞数量几乎为零.流式细胞检测K562/G细胞内ROS水平明显高于K562细胞(P=0.000 1),相同浓度IM作用于两株细胞相同时间,K562/G细胞凋亡比例低于K562(P<0.05).RT-PCR结果显示K562/G细胞中STAT5A和STAT5B水平均高于K562(P=0.000 1、0.017 0).Western blot结果表明K562/G细胞中STAT5蛋白水平显著升高(P=0.009 0).结论 STAT5在慢性髓细胞白血病中高表达,STAT5-ROS通路的活化与K562细胞IM耐药密切相关.     

棘霉素对伊马替尼敏感及耐药K562细胞ERK、AKT和SPK表达的影响

目的比较棘霉素对伊马替尼敏感及耐药K562细胞ERK、AKT和SPK表达的影响。方法 MTT法检测细胞存活率,Western blot检测ERK和AKT的表达,同位素掺入检测SPK的活性。结果棘霉素对K562和耐伊马替尼细胞的IC50分别为0.82mg/L和0.87mg/L;棘霉素对ERK和AKT均有不同程度的抑制作用;耐药K562细胞中SPK的表达远高于敏感细胞,且棘霉素对耐药细胞中的SPK活性有显著抑制作用。结论棘霉素对敏感及耐药K562细胞均有较强的抑制作用,其机制与抑制ERK、AKT和SPK的作用有关。     

异博定对白血病K562细胞耐药性的逆转作用

目的：研究异博定对Ｐ－糖蛋白（Ｐｇｐ）介导的人类白血病Ｋ５６２细胞多药药作用。方法：用台盼蓝拒染法检测药物敏感性及异博定对细胞耐药性的影响,用免疫组织化学法检测Ｐｇｐ的表达,用汉式细胞仪检测细胞柔红霉素（ＤＮＲ）积聚。结果：ＤＮＲ诱导的耐药细胞Ｋ５６２／Ｄ对ＤＮＲ,长春新碱（ＶＣＲ）、高三尖杉脂碱（ＨＨＴ）、鬼臼药物积聚增加,明显地逆转了Ｋ５６２／Ｄ细胞对ＤＮＲ、ＶＣＲ、ＭＩＴ、ＨＨＨＴ、ＶＰ－１     

甲孕酮对K562/AO2细胞及P-gp、Bcl-2耐药蛋白表达的影响

目的：探讨甲孕酮对白血病 K562/ AO2细胞凋亡率及 P - gp、Bcl -2耐药蛋白表达的影响。方法以 MTT法检测肿瘤细胞增殖的抑制率，流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡、P - gp 及 Bcl -2表达。结果甲孕酮能够提高 K562/AO2细胞的凋亡，能够下调 K562/ AO2细胞 P - gp、Bcl -2的表达。结论甲孕酮能提高 K562/ AO2细胞化疗敏感性，促进其凋亡，对 K562/ AO2细胞有一定的逆转耐药作用。     

藏红花素对耐伊马替尼慢性白血病粒细胞的促凋亡作用

[目的]分析探讨藏红花素对耐伊马替尼白血病细胞株K562/Ima的增殖抑制和促凋亡的机制.[方法]耐伊马替尼的白血病细胞株K562/Ima接种于96孔板中,经不同浓度的藏红花素分别处理48h采用CCK8法检测细胞增殖抑制情况,Hoechst染色藏红花素处理的细胞,荧光显微镜观察及采用Annexin V/PI双染分析藏红花素对K562/Ima细胞的促凋亡作用.K562/Ima细胞经藏红花素处理,及采用Caspase蛋白抑制剂处理,检测Caspase-3激活情况.[结果]细胞增殖抑制实验显示藏红花素能够显著抑制耐药K562/Ima细胞的增殖,呈一定的浓度依赖关系,P＜0.05.随着藏红花素浓度的提高,K562/Ima细胞凋亡率逐渐上升,表现为细胞皱缩,细胞核固缩,染色增强,出现核小体.荧光活性检测实验显示经藏红花素处理后,Caspase-3活性明显增强.采用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK作用后,Caspase-3活性被部分抑制,K562/Ima细胞凋亡率降低.[结论]藏红花素能够抑制K562/Ima细胞的增殖,诱导其凋亡,Caspase信号通路可能参与其中.     

甲基莲心碱联合mdr 1shRNA对K562/A02 细胞mdr 1/P gp表达的影响

目的：探讨甲基莲心碱(Nef)联合mdr 1shRNA表达的载体对K562/A02细胞mdr 1/ P gp表达的影响。 方法：采用MTT方法比较Nef,mdr 1shRNA单独或二者联合对K562/A02细胞增殖的抑制作用;采用RT PCR和Western印迹法检测mdr 1/P gp的表达。 结果：Nef与mdr 1shRNA联合组对K562/A02细胞的抑制率显著高于mdr 1shRNA,Nef单独处理组(P＜0.01);联合组对K562/A02细胞mdr 1/P gp表达的抑制作用强于单独处理组（P＜0.01）。 结论：甲基莲心碱能增强mdr 1shRNA表达载体对K562/A02细胞的增殖抑制作用及mdr 1/P gp表达的抑制作用,逆转mdr 1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。     

曲古菌素A对K562细胞中HDAC1表达的影响

目的研究表明组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC1)在多种肿瘤中高表达,曲古菌素A(trichostatin A,TSA)可以抑制肿瘤细胞的生长.该实验研究HDAC1在K562细胞的表达及TSA对其增殖的影响.方法50～400 nmol/L的TSA分别处理K562细胞8～48 h后用四甲基偶氮唑蓝(MTT法)比色检测K562细胞的生长活性;应用流式细胞仪法观察细胞凋亡.RT-PCR和蛋白印迹法(western blot)方法检测K562细胞在24 h不同浓度(50～400 nmol/L)的条件下HDAC1的mRNA和蛋白的表达以及TSA对其作用.结果TSA可显著抑制K562细胞的生长,诱导细胞发生凋亡,并呈时间及剂量依赖性.HDAC1的mRNA A值的半定量表达以及蛋白表达明显增强(P＜0.05),但随着浓度的增加而表达下调.结论TSA对K562细胞具有明显的增生抑制及诱导凋亡作用,抑制HDAC1的表达,可能是其重要作用机制之一.     

K562细胞survivin基因表达对淋巴细胞增殖和功能的影响

目的探讨K562细胞中survivin基因的表达对淋巴细胞增殖和功能的影响。方法将融合重组质粒pEGFP-C1-survivin和靶向survivin基因的RNAi的重组质粒pTZU6^＋1-survivin分别转染K562细胞,得到K562/survivin^＋和K562/survivin^-2种细胞,用G418筛选K562/survivin^＋细胞,用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法及免疫细胞化学法检测K562/survivin^＋和K562/survivin^-2种细胞中survivinmRNA及蛋白水平的表达,并与K562细胞作对照。将这3种细胞与健康人外周血单个核细胞（PBMC）混合培养（MLTC）,检测混合培养体系中淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性及培养上清中IFN-γ水平。结果K562/survivin^＋组的淋巴细胞增殖指数明显低于其余两组。survivin基因的表达水平与NK细胞活性呈负相关。混合培养上清中分泌的IFN-γ,K562/survivin＋组是K562组的1/4.5,是K562/survivin^-组的1/8。结论高表达的survivin可以抑制淋巴细胞的增殖、NK细胞活性及IFN-γ的分泌。     

siRNA对人红白血病细胞株（K562／ADM）阿霉素耐药性的影响

目的：研究小分子干扰RNA片段（small interfering RNA，siRNA）对人红白血病细胞株（K562／ADM）细胞mdr1基因表达及功能的影响，探索一新的耐药的逆转途径。方法：siRNA根椐GeneBank已知序列设计，在脂质体介导下转染K562／ADM细胞：用流式细胞仪检测K562／ADM细胞Pgp的表达及细胞周期的改变；用TUNEL法检测其凋亡；用MTTT检测其对阿霉素ADM的敏感性。结果：siRNA转染后K562／ADM细胞Pgp的表达明显下降，凋亡率明显提高，对阿霉素ADM的敏感性明显提高。结论：siRNA有效逆转了mdr1介导的耐药性，不失为一种新型、有效的肿瘤耐药逆转途径。     

汉防己碱对白血病K562细胞生长的促进耐药作用

目的考察汉防己碱(Tet)对白血病K562细胞生长的影响。方法采用体外细胞培养,即在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,培养液为含10%热灭活NBS的完全RPMI1640细胞培养基。待K562细胞与药物作用48 h后,收集并处理细胞,结合MTT和Western blot法研究Tet对K562细胞生长的作用特点。结果 Tet在0.33～1.00μg/ml仅使K562及K562/ADM细胞的存活率降低至75%～80%,低浓度Tet(0.33μg/ml)使阿霉素(ADM)和顺铂(cDDP)对K562细胞生长的IC50增加(P<0.01),1.0μg/ml Tet则降低IC50,使ADM对K562/ADM细胞的IC50增加,cDDP的IC50无明显变化。0.33μg/ml Tet有提升2种细胞的P-gp和MRP1表达的作用(P<0.05)。Tet各浓度对LRP表达无明显影响。结论 Tet对K562及K562/ADM细胞生长抑制作用具浓度依耐性,低浓度具加速耐药的作用,其促进耐药细胞发展的机制至少与提升P-gp和MRP1表达有关。     

榄香烯对多药耐药人红白血病细胞株的影响

[目的]探讨抗肿瘤药β-榄香烯对多药耐药细胞系的影响。[方法]利用MTT,荧光染料Hoechst33342染色、透射电镜的方法观察β-榄香烯对多药耐药性(mdr)人红白血病细胞株K562/ADM细胞的生长和凋亡的影响。[结果]β-榄香烯对K562/ADM细胞的抑制作用在5~40μg/mL的药物浓度范围内呈上升趋势,加药组24~72 h范围内细胞凋亡率不断增加,浓度40μg/mL 72 h时达高峰62.73%±,二者呈现药物浓度和作用时间依赖性(P<0.05或P<0.01)。[结论]诱导细胞凋亡是β-榄香烯抗肿瘤细胞作用机制之一。     

诱导K562细胞分化对EDAG基因表达的影响

目的研究EDAG在红系肿瘤分化中的表达及意义。方法用PCR的方法从人的血液基因组中分离出EDAG基因的调控区2200bp片段,将其克隆到pGL3-basic的含有荧光素酶报告基因的质粒中,转染K562细胞,用Hemin和PMA诱导细胞分化;通过不同时间检测荧光素酶报道基因的方法,观察用两种不同方法处理细胞后对EDAG基因表达的影响。结果用Hemin和PMA分别诱导K56272h和48h后,EDAG基因表达下调。结论用Hemin和PMA诱导K562细胞分化后,EDAG基因表达下调可能与细胞分化有关。