MTT显色反应实验条件分析

目的 :检验分析MTT实验方法本底高、灵敏度低、稳定性差的影响因素 ,改进实验条件提高灵敏度和稳定性 ,降低本底。方法 :用MTT比色方法 ,细胞毒试验及细胞增殖实验 ,分析比较不同条件下MTT显色反应的性能特点。结果 :比较了 13种溶剂对Formazan的溶解性能。分析检验了琥珀酸脱氢酶在细胞上的分布特点、pH值对MTT反应体系的影响、酚红和牛血清对检验结果的影响 ,提出相应对策。检测了MTT反应时间曲线和细胞活力曲线。分析了改进后的MTT实验方法的灵敏度和稳定性。结论 :以MTT为底物的酶在细胞代谢中主要分布在细胞膜表面。MTT反应体系的pH值为 6 7,比较好的Formazan溶剂是正丙醇、异丙醇和乙二醇乙醚。去掉细胞培养上清 ,检测细胞上的酶 ,用溶剂使蛋白质变性 ,经沉淀去掉蛋白质影响 ,能使MTT实验方法的本底降低 ,灵敏度提高。通常情况下该方法检测K 5 62细胞和人淋巴细胞的灵敏度分别为 10 0 0和 10 0 0 0个细胞左右。     

MTT比色法的改良及其在LAK细胞活性检测中的应用

目的：改良四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法,并用来检测淋巴因子激化的杀伤细胞（LAK细胞）活性。方法：在MTT代谢产物甲瓒DMSO溶解后的最佳吸光度测定及效靶细胞不同孵育时间的比较等方面进行研究。结果：MTT代谢产物甲瓒DMSO溶解后的最佳吸光度为510nm,效靶细胞最佳孵育时间为4h。结论：改良的MTT比色法优于常规的MTT比色法。     

改良MTT比色法检测NK细胞活性

目的 :探求更简便、实用的改良四甲基偶氮唑盐 ( MTT)比色法检测 NK细胞活性。方法 :1 2只 Wistar大鼠 ,取脾淋巴细胞 ,用 MTT比色法测定 NK细胞活性 ,效、靶细胞分别先孵育0 h和 4h,再与 MTT共同孵育 4h两种方法 ,对不同孵育时间的实验结果进行 t检验和相关性分析。结果 :两种方法差异有统计学意义 ,呈高度正相关。结论 :可以用效靶细胞不进行预先孵育的方法检测 NK细胞活性     

穿孔素和颗粒酶的基础和临床研究进展

<正>细胞毒性淋巴细胞杀伤靶细胞主要是通过其释放的穿孔素和颗粒酶发挥作用,使靶细胞凋亡和坏死.随着分子生物学的发展,穿孔素和颗粒酶的研究越来越受到学者们的关注.本文就近来的发展综述如下.1 穿扎素和颗粒酶的产生穿孔素又称孔形成蛋白)(Pore-forming Protein,PFP).细胞溶素(Cytolysin)C_9(相关蛋白.它是一种蛋白酶,以能在靶细胞膜上形成孔道,破坏靶细胞膜的完整性而得名.细胞毒淋巴细胞溶解靶细胞时首先与靶细胞连接之后受靶细胞膜上的抗原刺激和T_H细胞释放的IL-2、IL-5的作用启动淋巴细胞的细胞毒颗粒释放,这些颗粒中含有穿孔素和颗粒酶且是溶解性淋巴细胞发挥细胞毒作用的主要效应物质.     

应用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞活性的研究

本文探讨了乳酸脱氢酶释放法,用于人外周血NK活性的测定。经过反复试验,对实验方法有以下几点改进。1.效应细胞和靶细胞用量的比例,由10:1改为20:1。2.表面活性剂使用NP-40和Triton x—100均可,适宜浓度为1％。3.酶促反应终止时间,确定为30min。本法简便易行、稳定、可靠,适合于基层临床检验工作,可以推广应用。     

颗粒酶杀细胞的机制

颗粒酶是活化的细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的效应分子,主要介导细胞凋亡。其分子生物学特征从一定程度上揭示了它的作用。其细胞毒作用是与导致靶细胞凋亡的其他因素相关的,穿孔素是否介导了颗粒酶的进入值得探讨,caspases及其底物作为颗粒酶的潜在底物倍受关注。     

腺病毒感染时抗体依赖细胞溶解效应的实验研究

本文利用同位素释放法及胎盼蓝染色等技术进行实验。结果表明,受腺病毒感染的靶细胞在抗体致敏后,补体及抗体依赖性细胞毒细胞均未能诱发出特异的细胞溶解效应,即无补体素(CDC)及抗体依赖性细胞毒(ADCC),由此证明 在腺病毒感染后它们在组织细胞的损伤中不起作用。提示:细胞免疫在腺病毒感染损伤中起中心作用;被输入的抗体能达到中和病毒、防止感染扩散的作用。     

免疫效应细胞增殖与细胞毒性功能检测3种方法的比较

目的：对比研究用于检测免疫效应细胞增殖与细胞毒功能的方法。方法：分别采用CCK?8法、EdU标记法、CFSE标记法检测不同培养条件下NK92细胞增殖［组1：100 U/mL白细胞介素（interleukin,IL）?2;组2：100 U/mL IL?2+10 U/mL IL?15］。用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放法、活细胞染料双标流式法、荧光素酶法检测两组NK92对K562细胞的杀伤。结果：CCK?8法检测结果提示组2增殖能力强于组1,但差异无统计学意义（P＞0.05）,而EdU和CFSE标记法均提示两组间增殖能力有显著差异（P＜0.05）。活细胞染料双标流式法与荧光素酶法均能够检测出不同效靶比下两组NK92细胞毒功能的差异（P＜0.05）,LDH释放法在低效靶比下未检测出两组细胞毒性的差异（P＞0.05）。以双标流式法的检测值为标准参照,荧光素酶法和LDH释放法的检测值与其呈显著相关性（rS=0.979 4,P＜0.001;rS=0.973 2,P＜0.001）。结论：CCK?8法更侧重于检测代谢活性,EdU和CFSE标记法更适用于悬浮类免疫细胞的增殖检测。3种细胞毒功能检测具有一致性,活细胞染料双标流式法适合检测对悬浮类靶细胞的杀伤,荧光素酶法比LDH释放法更适用于检测对贴壁细胞的杀伤作用。     

自然杀伤细胞单个细胞细胞毒试验方法的改进

~(51)Cr释放方法只能反映效应细胞的群体细胞毒的活性,难以判定该群体中效应细胞的数量及每个效应细胞细胞毒活性的强弱,更不能反映单个细胞杀伤的特征及动态。近年来,国外学者建立的单个细胞试验方法能在单个细胞水平上研究杀伤细胞与靶细胞的结合能力以及杀伤靶细胞的各种特征及机制。这种方法     

抗人食管癌单克隆抗体和争光霉素A_6结合物的制备及其对食管癌细胞的细胞毒作用

研究目的探索食管癌导向化疗的途径研究设计用异双功能基试剂SPDP联接抗人食管癌单抗和争光霉素A_6,然后用MTT法测定该结合物对食管癌细胞的特异性细胞毒作用。研究单位新乡医学院基础医学部处理方法采用MTT法,通过测定细胞代谢活性来反映单抗—A_6结合物对食管癌细胞的特异性杀伤作用。靶细胞为食管癌细胞Eca8714,非靶细胞为宫颈癌细胞HL,设有结合物组和对照组(游离A_6)。结果结合物对食管癌细胞的杀伤率比游离争光霉素强10倍。0.1μM时即显示杀伤癌细胞活性。首次发现争光霉素A_6对宫颈癌细胞HL的杀伤率明显高于对食管癌细胞Eca8714的杀伤率。结论单抗和争光霉素A_6的结合物显示出较好的特异性细胞毒作用.为食管癌导向化疗迈出了有益的探索性的一步。     

树突细胞免疫对HPV感染阳性角朊细胞生物学特性影响

目的 观察树突细胞免疫对HPV感染阳性角朊细胞（HPK）增殖特性的影响及诱发杀伤性T淋巴细胞（CTL）细胞毒活性的变化。方法 用计数法绘制生长曲线、流式细胞仪（FCM）检测DNA含量及细胞周期的变化，以观察HIPK增殖特性变化，同时用^51Cr释放法测定树突细胞免疫前后细胞毒性淋巴细胞（CTL）对HIPK的细胞毒作用。结果 树突细胞免疫后，HIPK生长延缓，增殖幅度降你，倍增时间（Dt）延长，HIPK的Dt为24．7h，DCs细胞培养上清作用后HIPK的Dt为41．6h，FCM检测HIPK的G0／G1，S，G2／M各时相细胞百分比（％）分别为：57．6，28．5，13．9；DCs细胞培养上清作用组分别为61．7，20．3，11．2。两者增殖指数（PI）比较差异显著（P＜0．01）。另外没有观察到HIPK凋亡，而DCs培养上汪作用组却观察6．8％的凋亡率，^51Cr释放实验中，效－靶比为10：1，5：1，2：1时，DCs治疗组CTL对HIPK杀伤率（％）分别为37．6，21．4，13．7；而对照组为5．6，2．9，1．6。结论 树突细胞免疫后HIPK出现了一定的增殖抑制现象，同时诱导了CTL的杀伤作用。     

3种T细胞系细胞毒作用的比较

目的 探讨Ｔ细胞的杀伤机制。方法 采用＾５１Ｃｒ释放试验,检测了３种Ｔ细胞系（ＯＥ４,４Ｑ１１,ＢＫ１）对瘤细胞ＴＡ３的细胞毒作用。结果 ＣＤ４＾＋Ｔ细胞系ＢＫ１,４Ｑ１１也具有特异的杀伤作用。结论 除ＣＤ８＾＋ ＣＴＬ外,还存在ＣＤ４＾＋,ＣＴＬ,其杀伤作用依赖于Ｆａｓ／ＦａｓＬ途径。     

Prostein31-39特异的、HLA-A*2.1限制性NKT细胞表型及功能初步研究

目的诱导培养前列腺癌相关抗原Prostein特异性NKT细胞,并对其表型及功能作初步研究鉴定。方法以Prostein31-39肽、IL-2、IL-12反复刺激培养HLA-A*2.1 健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs),对得到的细胞系进行细胞毒功能试验,并以多色流式细胞检测技术进行表型分析。结果Prostein31-39肽、IL-2、IL-12可以诱导PBMCs产生肽特异性CD3 /CD56 NKT细胞,具有较强的肽特异性细胞毒活性及NK样细胞毒活性。结论Prostein31-39肽、IL-2及IL-12可以协同诱导培养肽特异性NKT细胞,这为研究抗原特异性NKT细胞在前列腺癌免疫治疗中的作用奠定了基础。     

几种肿瘤病人外周血NK细胞活性变化的研究

本文报道用~(51)铬—释放试验检测几种肿瘤病人外周血中NK细胞活性的变化。证明进展期肿瘤病人NK细胞活性明显下降,术后数年未复发的病例NK细胞活性恢复正常。NK活性测定可为估计肿瘤病人预后提供有力的实验依据。     

室内气传真菌代谢产物的细胞毒性研究

目的：观察研究室内常见气传真菌代谢产物的细胞毒性。方法：MTT比色法和细胞克隆形成率实验观察了室内常见气传真菌代谢产物对中国仓鼠肺细胞(CHL)的存活和增值能力的影响，并通过检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、胞内、K^ 含量，观察真菌代谢产物对细胞膜通透性的影响。结果：随着室内常见气传真菌代谢产物剂量的上升，培养液中LDH相应上升，细胞内K^ 浓度降低，而细胞外的Ca^2 有内流趋势。结论：常见气传真菌代谢产物能够损伤细胞膜，具有细胞毒性作用。     

LAK细胞可溶性因子介导K_(562)细胞的损伤

采用~(51)Cr释放方法探讨LAK细胞可溶性因子介导的K_(562)细胞的损伤。15例中有12例LAK细胞培养上清介导的K_(562)细胞的损伤为10.96±5.15％。将LAK细胞洗去培养上清后与K_(562)细胞共育6小时,5例此种效靶细胞共育后的上清介导的Ks6z细胞的损伤为12.41±6.54％。结果表明,LAK细胞杀伤K_(562)细胞的作用至少一部分是由LAK细胞分泌的可溶性因子完成的。     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的探讨体外经角蛋白19（K19）致敏的树突状细胞（DC）诱导的细胞毒T细胞（CTL）对MCF-7细胞株的抑瘤作用.方法经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,3H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,51Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性.结果外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高（P＜0.01）.在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）,且随着效靶比增加,杀伤作用增强（P＜0.01）.结论DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强.     

双特异性抗体介导的CD3AK体外杀伤实验研究

目的:研究在双特异性抗体的介导下CD3AK细胞(CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞)对人小细胞肺癌细胞株LTEP-sml细胞毒作用。方法:用51Cr-Na2CrO4释放试验检测单抗(2D6、UCHT1)和双特异性抗体(WST-HT)与CD3AK共同对人小细胞肺癌细胞株的杀伤活性。结果:双特异性抗体外能明显增强CD3AK细胞对人小细胞肺癌的杀伤活性。结论:与单纯CD3AK相比加入双特异性抗体后的CD3AK细胞的细胞毒活性显著增强。     

尤文肉瘤融合基因修饰的重组腺病毒的构建及其转染的树突细胞体外抗尤文肉瘤免疫应答

目的:构建尤文肉瘤融合基因EWS-FLI1重组腺病毒,利用此腺病毒感染外周血单核细胞(PBMC),培养树突细胞(DC),检测感染后的DC致敏的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用.方法:将质粒Pec1/ EWS-FLI1酶切,切出的EWS-FLI1 cDNA片段克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv的hCMV启动子下游.将穿梭质粒和骨架质粒共同转化大肠杆菌BJ5183菌株,获得同源重组后的腺病毒质粒pADeasy-1/ EWS-FLI1.将此质粒转染293细胞,包装产生腺病毒Ad EWS-FLI1.扩增、纯化产生高滴度的Ad EWS-FLI1.转染PBMC并经过鉴定后致敏淋巴细胞,4 h 51Cr释放试验测定致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用.结果: 同源重组后产生的pADeasy-1/ EWS-FLI1经PCR鉴定构建成功,纯化后的滴度为4×10¹⁰/mL.转染PBMC后,RT-PCR证实有EWS-FLI1 mRNA的转录.致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系有明显的杀伤作用,效靶比在40:1时,对尤文肉瘤673细胞系的杀伤率为35.1800%±0.0128%,和对照组相比差异有统计学意义. 结论 :重组腺病毒Ad EWS-FLI1构建成功,并能在PBMC中稳定有效地表达,Ad EWS-FLI1转染的DC可高效地诱发机体T细胞的特异性抗肿瘤免疫应答作用.     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的 探讨体外经角蛋白19(K19)致敏的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒T细胞(CTL)对MCF-7细胞株的抑瘤作用。方法 经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,³H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,⁵¹Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性。结果 外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高(P<0.01)。在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性(P<0.01),且随着效靶比增加,杀伤作用增强(P<0.01)。结论 DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强。