幽门螺杆菌hpaA基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及其活性鉴定

目的:优化幽门螺杆菌hpaA基因工程菌(pMAL-c2X-hpaA-TB1)的表达条件,并对其表达产物进行纯化和免疫活性鉴定.方法:通过诱导表达实验了解不同诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间对蛋白表达量的影响, 并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性HpaA蛋白进行分离、纯化;对纯化后蛋白做Western blot实验鉴定免疫活性.结果:该工程菌培养2 h时加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol/L进行诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上;经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫活性.结论:建立了从TB1(pMAL-c2X-hpaA)可溶性表达产物中纯化高纯度rHpaA融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌发酵、高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

核受体PPARγ-LBD在原核系统的最适表达及纯化

目的　探索诱导PPARγ LBD的最适表达条件 ,提高可溶性PPARγ LBD蛋白在大肠杆菌中的表达量 ,然后用Ni2 + NTA离子交换树脂对表达蛋白进行分离纯化。方法　PPARγ LBD在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中进行诱导表达时 ,以不同IPTG浓度、不同温度 ( 3 7℃ ,3 0℃ ,2 0℃ ) ,确定可溶性PPARγ LBD蛋白表达的最适条件 ;然后用Ni2 + NTA离子交换树脂进行分离纯化 ,其产物进行SDS PAGE纯度分析和Westernblotting鉴定。结果　建立了重组蛋白PPARγ LBD的最适诱导条件 ,即 0 .5mmol LIPTG浓度 ,2 0℃诱导 14h其可溶性表达蛋白的量最高 ;纯化产物经SDS PAGE纯度分析大于 90 %以上 ;Westernblotting检测 ,纯化产物为PPARγ LBD目的蛋白 ,其分子质量约 3 4× 10 3。结论　重组蛋白PPARγ LBD在E .coli中进行了成功表达和纯化 ,并且降低温度可提高可溶性蛋白PPARγ LBD表达量达 5 0 %以上     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白与麦芽糖结合蛋白融合表达产物rMBP-NAP的分离纯化

目的：从E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)细菌中分离纯化与麦芽糖结合蛋白融合表达的重组幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白rMBP-NAP,筛选幽门螺杆菌口服疫苗抗原组分。方法：0．3mmol／L IPTG在37℃,230r／min条件下诱导基因丁程菌E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)3h。4℃ 4000g离心20min收获细胞。过柱缓冲液重悬细胞,一20℃冻仔过夜,在冰水浴中超卢破碎工程菌,4℃,9000g离心30min,十二烷基磺酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析工程菌中rMBP-NAP可溶性;低相对分子质量蛋白Marker做标准对照,GeneTool测定诱导蛋白相对分子质量。FPLC分子排阻层析法分离rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描法测纯化蛋白质的纯度,Bradford法检测蛋白质含量。结果：E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)诱导表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,占上清中蛋白总量的39．35％,相对分子质量约为57000,与预期结果一致;分子大小排阻层析一步法纯化rMBP-NAP纯度可达91％,含量可达0.121g/L。结论：FPLC分子排阻层析可从大肠丁程菌超声菌液巾快速纯化rMBP-NAP。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白表达影响因素分析

目的优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导温度为37℃,诱导表达6.0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以0.1mmol/L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0.6mmol/L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4.0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Western blotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0.3mmol/L时,融合蛋白GST-NS1在IPTG诱导5.0h时的表达量最高,达28.5%;当IPTG诱导浓度为0.6mmol/L,在37℃诱导表达4.0h时,融合蛋白的表达量可达27.9%。选用优化的表达条件,IPTG 0.6mmol/L,37℃诱导表达4.0h,融合蛋白的表达量最高可达33.2%。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25.1%。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

重组人VEGF165工程菌的发酵及表达产物的纯化与活性测定

目的:优化重组人VEGF165(rhVEGF165)工程菌的发酵条件,分离纯化目的蛋白并检查活性.方法:考察了甲醇诱导浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响;发酵液经离心、透析后,经肝素亲和柱层析、超滤制得纯品;采用CAM实验和血管内皮细胞MTT法测定生物活性,比较了与人VEGF165标准品的免疫原性.结果:最佳表达条件为:甲醇诱导浓度为1%,诱导时间为5～6 d;采用Heparin-Sepharose CL6B亲和层析后,产物纯度可达90%以上;活性测定结果显示,目的蛋白具有促血管生成作用;与人VEGF165具有相似的免疫原性.结论:经发酵纯化后获得了有活性的重组人VEGF165纯品.     

Histatin5可溶性突变体融合蛋白在大肠杆菌中的优化表达

目的优化表达条件,提高Histatin5突变体融合蛋白(GST-HST5)表达量。方法比较不同IPTG诱导浓度、不同诱导后培养时间,确定优化表达条件。结果 histatin5突变体融合蛋白经1mmol/L IPTG,37℃诱导6h,表达量最高。结论诱导表达条件对Histatin5突变体融合蛋白表达有较大影响。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白表达及条件优化

目的:优化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白表达条件,探索包涵体复性和纯化方法。方法:用IPTG诱导pGEX-6P-1/TRAIL在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经稀释复性和透析复性法使GST-rTRAIL蛋白恢复天然构象;并运用Glutathione-Superflow Resin亲和层析柱纯化GST-rTRAIL目的蛋白,Western blotting分析目的蛋白。结果:GST-rTRAIL在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约40 kDa的蛋白条带,与预期值相符,该蛋白以包涵体形式存在;0.2 mmol.L-1IPTG 37℃诱导8 h时,全菌蛋白表达量最高;复性后的蛋白溶液经Glutathione-Superflow Resin亲和层析纯化获得纯的目的蛋白,Western blotting显示能被鼠抗GST的标签抗体识别。结论:本实验结果显示IPTG浓度为0.2 mmol.L-1,37℃诱导8 h,GST-rTRAIL全菌蛋白的表达量最高;GST-rTRAIL蛋白包涵体经稀释复性、透析复性和Glutathione-Superflow Resin亲和层析柱分离纯化获得目的蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定基础。     

重组人可溶性补体受体1型SCR15-18片段表达纯化及生物活性鉴定

目的 获得高表达、高纯度和高活性的可溶性补体受体1型SCR15-18 (sCR1-SCR15-18)蛋白.方法 重组原核表达载体pET32a-sCR1-SCR15-18 在大肠杆菌BL21中经不同IPTG浓度、诱导时间和温度诱导表达,超声破菌,提取包含体,经Ni2 -NTA 亲和层析后,选择不同氧化还原条件进行复性,进而检测其生物学活性.结果 得到了有较高表达量、较高纯度和较好生物学活性的sCR1-SCR-15-18蛋白.结论 优化了sCR1-SCR15-18蛋白的表达、纯化和复性的参数,所获结果为进一步动物体内保护实验研究奠定了基础.     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。     

幽门螺杆菌外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因原核表达系统的构建与鉴定

目的:构建表达幽门螺杆菌(Hp)的外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因的重组蛋白质候选菌株,为Hp疫苗研究提供依据. 方法:用PCR方法扩增出带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因omp22-hpaA, 将其克隆到表达载体pMAL-c2X中转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western Blot鉴定其免疫原性. 结果:测序结果显示, omp22-hpaA融合基因片段由1326 bp组成,为编码440个氨基酸残基的多肽,接头序列GGTGGAGGC已成功地插入omp22-hpaA融合基因中;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为53 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的20%. 结论:成功克隆并构建了omp22-hpaA融合基因原核表达系统.     

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体,并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中,采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h）,目的蛋白获得较高表达量,且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566,TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达,经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。     

重组人C22orf37融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的：构建人C22orf37基因的原核表达载体,表达并纯化C22orf37重组蛋白．方法：应用PCR方法从人外周血白细胞eDNA文库中获得人C22orf37基因,成功构建人C22orf37融合表达载体,诱导表达His—C22orf37融合表达蛋白并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot鉴定．应用镍螯合层析法纯化重组融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析．结果：成功构建了人C22orf37重组融合载体pQE30-C22orf37,工程菌pQE30-C220rf37／DH5α经IPTG诱导后的菌体蛋白经SDS—PAGE电泳分析,在Mr约18000处出现了一条新生的蛋白条带,Western Blot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合．应用Ni—NTA层纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白经Primer Premier软件分析纯度约80％．结论：成功构建了人C22orf37的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化了人C22orf37的融合蛋白,为下一步的C22orf37 mAb的制备和C22orf37蛋白表达的组织分布及功能研究奠定了基础．     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

人可溶性TRAIL蛋白表达及纯化条件优化

目的：优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7．4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0．2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

CTLA—4在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 在原核表达系统大肠杆菌中表达具有生物活性的人毒性T淋巴细胞相关蛋白－4可溶性部分（human soluble CTLA-4)。方法 PCR扩增获得CTLA－4编码基因,利用表达载体pGEX－2T构建重组质粒2TC,在所获DNA片段与文献报道CTLA－4序列一致。在重组大肠杆菌中0．10mmol/L IPTG诱导4h可大量生成相对分子质量40000的GST－CTLA4融合蛋白。Westen blot分析表明原核表达产物CTLA－4具抗原抗体结合活性。结论 hsCTLA－4可在原核表达系统中表达并具有免疫活性。     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。