水蛭素基因工程菌的培养

采用正交实验法优化了水蛭素基因工程菌的发酵培养基，得到较佳培养基配方及培养条件，并优化了发酵工艺，摇瓶培养22h，发酵液抗凝血酶活力可达850ATU/ml，25L发酵罐培养18h，发酵液中抗凝活力亦可达800ATU/ml，水蛭 素表达量在原有基础上有了大幅度提高，为大规模培养及工业生产建立了可行路线。     

水蛭素基因工程菌的培养条件优化

通过正交实验对水蛭素基因工程菌的发酵培养基进行了优化,并由此得到较佳培养基配方为玉米浆4.5%,牛肉膏2.5%,谷氨酸钠1.5%;以此优化培养基在初始PH6.5,种龄12小时和温度37℃等条件下,摇瓶发酵液水蛭素活力可达到1200ATU/ml.     

重组水蛭素Ⅲ的中试工艺研究

从大肠杆菌中大规模纯化重组水蛭素Ⅲ,进行重组水蛭素Ⅲ中试发酵工艺和纯化中试工艺研究,连续大量纯化3批,并对纯化终产品进行鉴定。通过菌种活化,一级、二级种子液制备,30L发酵罐补料-批式发酵水蛭素产量达到6000ATU/ml,发酵液经还原性SDS-PAGE分析表明在14000u处有单一条带,为重组水蛭素Ⅲ二聚体。经大孔树脂层析、DEAE-纤维素层析、制备型反相高效液相层析等3步纯化后重组水蛭素Ⅲ的比活达8270ATU/mg。经分析型反相高效液相色谱分析,纯度达95%以上,总收率达到39%以上。通过实验建立了稳定的发酵和纯化工艺流程。     

子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化

摘要：基于子囊霉素的生物合成途径和机制，根据生物合成基因簇序列设计引物，应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因，整 合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中，成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌，命名为 AS-07。将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究，结果表明，与野生菌相比，子囊霉素的产量提高了25%。通过初步优化摇瓶发酵工 艺，AS-07工程菌与野生菌相比，子囊霉素的产量提高了85%。     

发酵条件对毕赤酵母工程菌产rhBSP的影响

Pichia pastrois酵母工程菌GSll5／pPICZaA—hbsp能分泌表达重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)。本文通过其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达rhBSP的最适条件。以BMGY作为种子培养基，菌体密度A500达到9时，重悬于1／5体积的BMMY培养基中，A500达到45，pH值6．0，2％甲醇诱导4d，rhBSP产量达高峰期，最大表达量为0．255g/L。     

重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定性考察

研究基因工程菌E.coli ASl. 357在LB培养基中传代50代过程中菌种的稳定性.以菌体和菌落的形态、质粒稳定性(ST)、质粒酶切图谱和水蛭素的表达量以及比活等方面进行考察,以评价工程菌的稳定性.重组水蛭素Ⅲ工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性高,传代10代内质粒稳定性(ST)为98%,且表达稳定,表达产物可达发酵液可溶性蛋白总量的60%,产物的抗凝血酶活力大于2.0×103ATU/ml,传代50代的菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态.重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定.     

工程菌LacU V5par8egf产hEGF发酵方法的比较

目的：明确培养条件对工程菌LacUV5par8egf表达水平和质粒稳定性的影响,方法：采用优化MBL培养基,利用摇瓶发酵研究工程菌LacUV5par8egf的最优培养条件,并与2L发酵罐上的发酵进行比较,结果：摇瓶发酵的最优培养条件为：温度32度,接种量10％,种子液OD5501．0－3．0,装液量10％,摇床转速220rpm;摇瓶发酵的最优诱导条件是在对数生长中后期诱导,IPTG最适浓度为0．2mM,2L发酵罐发酵与摇瓶发酵相比,发酵周期缩短了约三分之一,hEGF表达水平接近摇瓶中发酵水平,达到27．7mg/L,结论：利用摇瓶最优培养条件,较好实现了重组hEGF从摇瓶到发酵罐的放大。     

60Coγ射线对南昌霉素产生菌的诱变选育

采用不同剂量的^60Coγ射线，对南昌霉素产生菌南昌链霉菌80-5.3-116菌株的孢子进行处理。结果表明，7.74c/kg的诱变剂量在对孢子致死率为90％左右时，具有较好的诱变效应；初筛摇瓶产量正变率达到21.08％；复筛摇瓶发酵效价比出发菌株提高50％以上的有10株，占初筛菌株的5％；连续四批摇瓶发酵试验平均产量比出发菌株的产量提高50％以上；有6个菌株摇瓶产量分别比出发菌株提高60％，其中3株平均摇瓶产量比出发菌提高70%以上。     

重组复合干扰素摇瓶发酵条件的研究

目的对表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coli DH5α的摇瓶发酵条件进行研究。方法利用单因素比较实验及正交试验等方法考查工程菌摇瓶发酵条件,探讨发酵条件对工程菌的生长和con-IFN表达的影响。结果优化后条件为培养基含玉米粉6%、牛肉膏5.5%、谷氨酸钠0.5%,发酵液初始pH 7.2,30℃培养7 h后升温至42℃诱导表达6 h,转速220r/min,装样量10%,接种量2%。结论优化后平均蛋白质表达量达到36.39%,和LB培养基相比,目的蛋白质表达量提高了4.8%,为工程菌的大规模发酵提供参考。     

紫杉醇产生菌美丽镰刀霉K178的诱变育种

采用紫外线与亚硝酸对美丽镰刀霉（Fusarium mairei）K178的孢子进行复合诱变，于含40μg／ml制霉菌素的平板上进行筛选，获得31株突变株，其中5株的紫杉醇摇瓶发酵产量高于出发菌株，突变株UH23的紫杉醇产量为259．8μg／L，进一步优化其发酵工艺条件，紫杉醇产量达286．4μg／L，较出发菌株提高了29．9％。     

复合诱变筛选avermectins高产菌株

由Streptomyces avermitilis初始菌株经过自然分离可以得到三种不同类型的菌株，即灰色粉末型、白色和光秃型。其中灰色粉末型产素水平最高，摇瓶发酵效价达到6835．1μg／ml，B1组分达到56．3％。经过紫外线和亚硝基胍对初始菌株的孢子的诱变及对其原生质体的诱变再生。并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选，得到的高产菌株摇瓶发酵效价达到8542．9μg／ml，B。组分达到64．9％；同时通过对高产菌株进行传代培养检验其传代稳定性，结果表明，传代3代后，菌株开始退化，并且其发酵效价有比较显著的下降。     

重组人胸腺肽α1工程菌的高密度发酵

为实现重组人胸腺肽α１工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＴｈｉｏ Ｈｉｓ－Ｔα的高密度高表达发酵,首先进行了培养条件的摸索,确定了该工程菌的最佳培养条件、诱导剂ＩＰＴＧ的浓度、诱导起始和结束时间,然后用５Ｌ自控发酵罐进行分批补料培养,发酵中采用分阶段限制性流加氮、碳源,保持溶解氧在３５％左右,结果经３ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ,３批重复发酵,最终菌体密度均达到６０Ａ６００以上（相当于干菌２５．６ｇ／Ｌ）,保持了并超过了该重组蛋白在试管和摇瓶中的表达量,融合蛋白Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ－Ｔα的表达占菌体总蛋白的４２．４％左右,含量达到了５．７ｇ／Ｌ,相当于胸腺肽α１ ２．４ｇ／Ｌ,为胸腺肽α１的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

重组死亡素裂殖酵母工程菌发酵的研究

在裂殖酵母基本培养基的基础上，通过正交设计，优化了培养基6个组分；优化后的培养基，摇瓶发酵，目的蛋白产量在26～51mg／L之间，发酵罐的批次发酵，产量在51～102mg／L之间。     

肝素酶的发酵工艺研究

优化了发酵培养肝素黄杆菌生产肝素酶的半合成培养基配方，种子液种龄48h，接种量10％，装量90ml／（750ml摇瓶），25℃培养32h。采用该优化方案，肝素酶的发酵水平可达1768u／L，较合成发酵培养基提高52％。     

茯苓摇瓶补料液体发酵和发酵罐补料液体发酵

在茯苓摇瓶液体发酵条件研究的基础上，进一步探讨了茯苓摇瓶补料液体发酵和发酵罐补料液体发酵的发酵工艺，为其产业化打下基础。通过每升发酵液中茯苓菌丝体干重的测定，确定最佳的液体发酵补料工艺。发酵罐液体补料发酵较摇瓶补料液体发酵大大缩短了发酵时间，使发酵时间从168h缩短为120h；发酵罐液体补料发酵还较摇瓶补料液体发酵提高了茯苓的生物量，使菌丝干重从10．74g／L增长到11.95g／L。     

氮离子注入土霉素产生菌诱变高产菌株的研究

以土霉索生产菌株48。为出发菌株，采用氮离子注入诱变处理，经摇瓶筛选，得到土霉素02—2-44^#菌株。该菌株特性优良，经57m^3发酵罐试验。150批平均发酵效价高于对照菌株（1158．6μg／ml），提高3．42％。发酵总亿及发酵指数分别提高3.17％和3．99％。     

姬松茸液体培养工艺条件的研究

研究了各种营养因子对姬松茸深层发酵的影响，确定了合适的碳源，氮源，C／N比，无机盐，生长因子的浓度，在初始pH5.5,250ml摇瓶装液量50ml，接种量15％，温度26℃的培养条件下，姬松茸深层发酵结果最佳，在此基础上进行摇瓶发酵曲线测定，确定了姬松茸适宜发酵周期为108h，发酵液胞外多糖最高可达3.48g/L。     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.     

微生物发酵法生产利巴韦林的初步研究

以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）TM903（Ade^- ＋8-AG^t＋MSO^t）为生产菌株，考察了前体物1，2，4-三唑-3-甲酰胺（TCA）、MnSO4、温度、pH及培养基装量对发酵法生产利巴韦林的影响，确定了其摇瓶发酵工艺：培养至24h时添加10g／LTCA及10mg／LMnSO4，24h后每6h升温2℃，采用磷酸缓冲液调节pH，在500ml挡板三角瓶中培养基装液量为25ml。该工艺条件下经60h发酵，利巴韦林的摇瓶发酵水平达5．11g／L。     

高密度培养工程菌生产谷胱甘肽

分析了一株具有高ＧＳＨ合成活性的重组大肠杆菌在摇瓶培养中对葡萄糖的利用能力,继而在２Ｌ发酵罐中研究了不同流加方式对该工程菌高密度培养生产ＧＳＨ的影响。结果发现,采用指数流加模式,发酵２５ｈ,细胞密度（干重）、ＧＳＨ总量和生产强度可分别达到８０ｇ／Ｌ、８８０ｍｇ／Ｌ和３．２ｇ／（Ｌ·ｈ）。