利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT，转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组，提取重组BacmidDNA质粒，转染昆虫细胞SD获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染SO细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达，通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBVP基因RT区段的重组杆状病毒，昆虫细胞Sf9中能检测到HBVP基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。     

鼠IL-2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的构建携带鼠IL-2基因的重组杆状病毒表达载体。方法将目的基因鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒;收获完整重组杆状病毒,反复感染Sf9细胞扩增病毒,提取杆状病毒基因组,用PCR验证重组杆状病毒的正确性。结果成功构建鼠IL-2基因杆状病毒表达载体。结论本试验为进一步在哺乳细胞中表达鼠IL-2基因、开发研究IL-2奠定了基础,同时亦为其他蛋白质的真核细胞表达提供了方法参考。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

昆虫细胞偏爱密码子优化的HPV16L1基因在昆虫和哺乳动物细胞中的表达

目的获得有效表达人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1基因的重组杆状病毒和腺病毒，为研究HPV的免疫保护机制提供材料。方法按照昆虫细胞密码子偏爱优化并合成HPV16LI基因，利用Bac—to-Bac昆虫表达系统获得表达HPV16L1基因的重组杆状病毒，利用AdEasy腺病毒载体系统获得表达HPV16L1基因的重组腺病毒载体。通过间接免疫荧光和Westernblot对HPV16L1基因表达进行鉴定，利用负染电子显微镜观察病毒样颗粒（VLP）的形成。结果获得了稳定表达HPV16L1蛋白的重组杆状病毒和重组腺病毒载体，在Sf9细胞和293细胞中可有效表达能被抗HPV16L1单克隆抗体识别的L1蛋白，分子质量单位为56ku，在Sf9细胞中可观察到VLP的形成。结论按照昆虫细胞密码子偏爱进行优化的HPV16L1基因，在昆虫细胞和哺乳动物细胞内均可有效表达。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

Ⅱ型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定北大核心CSCD

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒多聚酶基因在重组杆状病毒系统中的表达

目的利用杆状病毒一昆虫细胞表达系统制备乙型肝炎病毒多聚酶重组蛋白。方法构建含有乙型肝炎病毒多聚酶基因的杆状病毒转移载体pFastbac Dual—polymerase，转化大肠杆菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid转染昆虫细胞获得含有HBVpol基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达，用SDS—PAGE电泳分析表达情况。结果将所得Bacmid行PCR鉴定，结果表明成功构建了的含乙型肝炎病毒多聚酶基因的重组杆状病毒，SDS-PAGE分析表明该病毒能在昆虫细胞中高效表达重组的多聚酶蛋白。结论利用杆状病毒表达系统，构建的重组杆状病毒在昆虫细胞中高效表达乙型肝炎病毒多聚酶，为进一步的乙型肝炎病毒多聚酶的体外功能研究奠定了基础。     

虎α干扰素与虎白蛋白融合蛋白的表达与鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达虎干扰素蛋白及其融合白蛋白后的长效干扰素蛋白。方法合成虎α干扰素基因IFN-α和融合虎白蛋白的长效干扰素基因IFN-α+ALB,经双酶切和酶连后转化大肠埃希菌DH5α获得重组质粒,鉴定正确后转化DH10Bac感受态,经蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒,测序验证后转染昆虫细胞Sf9,并进行盲传。提取P3代细胞的上清基因组,检测目的基因表达情况并大量培养。收集细胞,超声破碎,取上清,经镍柱纯化后获得蛋白IFN-α和IFN-α+ALB,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白的表达。并通过MDCK-H5N1系统进行重组蛋白的体外活性验证试验。结果构建的重组杆状病毒质粒测序验证正确,转染昆虫细胞Sf9后表达分子质量与预期相一致的两种蛋白,其体外活性试验显示长效干扰素抗病毒效果更好。结论成功构建了虎长效干扰素重组质粒,表达的IFN-α融合虎白蛋白具有长效干扰素作用,为进一步研究对比其与干扰素蛋白的功能奠定了基础。     

利用昆虫杆状病毒表达系统表达人KCTD9蛋白

目的应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(sf9细胞)中表达人KCTD9蛋白,以进行其功能学研究。方法从pMD18-T-hKCTD9质粒中扩增hKCTD9全长基因片段,连接至pENTR/D-TOPO载体,将pENTR/D-TOPO-hKCTD9质粒与线形杆状病毒DNA在体外重组后,转染易感细胞系昆虫sf9细胞。采用免疫共聚焦和WesternBlot法分析融合蛋白的表达;在电子显微镜下观察病毒颗粒的形成。结果凝胶电泳分析hKCTD9基因存在于各载体中;激光免疫共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒的sf9细胞核内可见绿色荧光,提示目的基因表达正确;WesternBlot进一步显示hKCTD9蛋白大小约为55KD;透射电子显微镜观察发现被感染的sf9细胞核涨大、透亮,核内清晰可见大量的杆状病毒颗粒。结论 hKCTD9在昆虫杆状病毒表达系统中被成功表达,为进一步功能学研究奠定了基础。     

日本血吸虫VCP基因的克隆表达及其在不同生活史期的mRNA表达水平

目的 目的 从原核表达日本血吸虫含缬酪肽蛋白 （VCP） 基因, 并分析其在不同生活史期的mRNA表达水平。方法 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA, 逆转录为cDNA, PCR扩增日本血吸虫VCP基因, 亚克隆至原核表达载体pET15b; 重组质粒转 化入E. coli BL21, 异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导目的基因表达, 并采用包涵体纯化方法获取重组蛋白, 产物行十二烷基 硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 进行分析鉴定。提取日本血吸虫尾蚴、 童虫、 雌虫、 雄虫、 虫卵RNA, DNase消化, 纯化后逆转录为cDNA, 采用荧光实时定量PCR分析VCP基因在上述生活史期的表达水平。结果 结果 PCR扩增获得日本血 吸虫VCP基因, 经重组质粒表达和包涵体纯化成功获得重组蛋白。荧光实时定量PCR检测发现, 日本血吸虫VCP基因在 尾蚴中的mRNA表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。结论 结论 获得日本血吸虫VCP基因编码的重组 蛋白; 日本血吸虫VCP基因mRNA在尾蚴阶段表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。。     

Expression,purification and serological analysis of hepatocellular carcinoma associated antigen HCA587 in insect cells

AIM: In order to assess hepatocellular carcinoma associated antigen HCA587 as a potential target for immunotherapy, the Bac-to-Bac expression system was used to express recombinant protein HCA587 in insect cells. METHODS: The cDNA encoding HCA587 gene was cloned into donor vector pFasBacHtb and recombinant pFasBac Htb-587 was transformed into competent cells DH10Bac. Recombinant Bacmid-587 was transfected into Sf9 insect cells using CELLFECTIN, Recombinant HCA587 protein was produced in Sf9 insect cells after infection with recombinant baculovirus, and was purified using Ni-NTA resin. Sera from HCC patients were also screened using recombinant protein HCA587. RESULTS: The molecular weight of the recombinant protein HCA587 expressed in insect cells was approximately 43kd. Western blot results proved the recombinant protein HCA587 had the similar antigenicity with its native counterpart. Serological analysis told that the rate of seroreactivity to HCA587 was not high in HCC patients. CONCLUSION: The recombinant protein HCA587 was successfully expressed and purified using Bac-to-Bac expression system. It paved the way for generation of specific antibody and investigation of immunohistochemical analysis and immune responses of HCC in the future.     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因真核表达质粒的构建及其序列分析

目的研究日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的生物学功能.方法根据已公布的日本血吸虫TCTP(SjTCTP)基因序列设计引物,从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出TCTP基因ORF序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.O中.结果通过PCR扩增、双酶切及测序鉴定证实重组质粒pcDNA3.O-TCTP已正确插入SjTCTP基因ORF序列,该序列具有TCTP特征性TCTP1和TCTP2结构.结论 SjTCTP基因真核表达质粒构建成功,为研究SjTCTP基因的生物学功能打下基础.     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。