bldD基因过量表达对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响

目的通过增加红色糖多孢菌调控基因bldD拷贝,获得红霉素高产菌株,并探讨bldD基因过量表达对红色糖多孢菌形态分化的影响。方法以红色糖多孢菌A226为出发菌株,通过染色体同源重组方法获得红色糖多孢菌A226bldD基因失活突变菌株A226-△bldD。将bldD基因表达质粒pZMW-bldD分别导入突变株A226-△bldD及出发菌株A226中,获得A226-△bldD/bldD菌株和A226/bldD菌株,利用TLC法和HPLC法对其发酵产物进行分析,并观察孢子生长状况。结果红色糖多孢菌A226中bldD基因失活后产红霉素水平明显降低,不能形成孢子;bldD基因的回复表达使A226-△bldD突变菌株产红霉素能力得到恢复,且孢子形成恢复正常;在红色糖多孢菌A226中过量表达bldD基因可提高红霉素产量,较出发菌株A226提高20%,同时可使孢子形成时间提前。结论在红色糖多孢菌中过量表达bldD基因,可获得红霉素高产菌株,同时会影响红色糖多孢菌形态分化进程。     

红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体的构建及产物分析

目的构建红色糖多孢菌糖基转移酶EryCⅢ失活突变体,为探索红霉素糖基结构修饰和合成新型红霉素衍生物打下基础。方法通过PCR扩增方法将eryCⅢ基因缺失130bp后,克隆至同源重组型质粒pWHM3上,构建pWHM3-ΔeryCⅢ,将其导入红色糖多孢菌A226中。经过两次同源重组,筛选出1株缺失EryCⅢ酶活性的红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体。使用抑菌实验、薄层层析和质谱对其发酵产物进行分析,并通过回补实验进一步验证。结果与结论对红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ染色体序列测定表明,eryCⅢ基因相应位点缺失130bp,突变菌株发酵产物对枯草芽孢杆菌无抑制作用,薄层和质谱结果表明突变菌株积累3-L-mycarose红霉内酯B（MEB）,而并没有发现红霉素产物。回补验证发现eryCⅢ基因导入A226-ΔeryCⅢ使得其恢复了红霉素合成能力。所构建的红色糖多孢菌EryCⅢ失活突变体A226-ΔeryCⅢ,为探讨组合合成红霉素衍生物奠定基础。     

糖多孢红霉菌引入异源启动子表达透明颤菌血红蛋白

目的为了在糖多孢红霉菌(Sac.erythraea)中表达透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),将变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)启动子基因整合于糖多孢红霉菌染色体中。方法以变铅青链霉菌基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆变铅青链霉菌启动子基因,利用基因重组技术构建含有异源启动子与vgb的重组糖多孢红霉菌表达质粒,经电穿孔法与糖多孢红霉菌染色体整合,红霉素效价测定采用管碟法。结果克隆了含有异源启动子与vgb的重组糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV),相对分子量6.033kb,筛选了重组糖多孢红霉菌株,原始菌株与重组菌株的最终红霉素效价分别为3.98、5.15g·L-1,重组菌株提高红霉素体积产率约29%。结论vgb在重组糖多孢红霉菌株引入异源启动子的情况下获得了表达,有望解决传统发酵过程中由于氧传递而导致的产率低下和成本高的问题。     

红色糖多孢菌ΔSACE_0065,ΔSACE_2559和ΔSACE_2565突变体构建及对孢子分化的影响

目的构建红色糖多孢菌ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变体并研究其功能。方法将待失活目的基因的上下游同源片段依次连接到pUCTSR质粒Thio抗性基因（tsr）两侧,利用PEG介导的原生质体转化法将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌A226内,通过同源重组使目的基因失活,最后将构建出的三个突变株与出发菌株A226及ΔbldD突变株进行比较,观察孢子生长有无差异。结果与结论成功构建ΔSACE_0065、ΔSACE_2559和ΔSACE_2565三个突变株;与A226相比,ΔSACE_0065和ΔSACE_2559气生菌丝和孢子形成推迟,而ΔSACE_2565突变株的生长情况则无明显变化,提示红色糖多孢菌SACE_0065、SACE_2559基因参与其形态分化的调控。     

红色糖多孢菌A226-YA突变体构建及产物分析

目的：用红色糖多孢菌（前称糖多孢红霉菌）KR6突变体合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，同时，KR6突变体不合成红霉素。方法：以红色糖多孢菌A226基因组DNA为模板，用重叠PCR技术扩增KR6酶域中Tyr2699密码子TAC突变为A1a密码子GCC的1000bpDNA序列，克隆到载体pWHM3上构建同源重组质粒pWHM3-YA。将pWHM3-YA转化到A226中，并整合到红霉素合成基因座，经染色体二次重组后筛选TAC突变为GCC的突变体A226-YA，再进行突变体A226-YA产物分析。结果：通过染色体同源重组，构建了红色糖多孢菌突变菌株A226-YA，Zabspec Fab质谱分析结果显示A226-YA突变体合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，而没有检测到红霉素。结论：突变Tyr2699能有效失活KR6，但3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的产量较低。     

红色糖多孢菌A226-SP突变体构建及代谢产物分析

目的：构建红色糖多孢菌突变菌株,生物合成酮内酯类抗生素。方法：利用反向PCR技术,扩增红色糖多孢菌KR6酮还原酶基因突变DNA片段SP（KR6酶中Gly^1141Ala^1142替换成SerPro）,克隆于pWHM3上构建染色体同源重组质粒pWHM3-SP。通过PEG介导原生质体转化,将pWHM3-SP导入红色糖多孢菌中。经染色体二次重组后,筛选出1株红色糖多孢菌KR6酶突变菌株A226-SP。结果：DNA序列分析表明,A226-SP染色体上编码KR6酶中Gly^1141Ala^1142序列GGTGCG突变成SerPro编码序列AGCCCT。HPLC—HRMS分析证实A226-SP菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B（DOEB）,同时检测到其中间产物C18H34O6,但没有发现红霉素产物。结论：Gly^1141Ala^1142位于KR6酮还原酶的重要功能位点,红色糖多孢菌A226-SP突变体可以合成酮内酯类化合物。     

氨溴索对铜绿假单胞菌密度感应缺陷株生物膜细菌活力和黏附作用的影响

目的 研究氨溴索对铜绿假单胞菌野生株PAO1及密度感应缺陷株(ΔlasI ΔrhlI基因缺陷)生物膜(BF)细菌活力及早期黏附的影响.方法 利用平板计数法测定不同浓度(0、1.875、3.75mg/ml)氨溴索对PAO1菌株、ΔlasI ΔrhlI菌株生物膜菌落的清除效应;荧光多功能酶标仪检测不同浓度氨溴索作用后PAO1菌株、ΔlasI ΔrhlI菌株的荧光强度,计算黏附率以反映干预对细菌黏附的影响.结果 氨溴索作用后,两种菌株的活菌生存率和黏附率均出现下降,ΔlasIΔrhlI株活菌生存率较PAO1株下降更明显(P＜0.05),而PAO1株黏附率较ΔlasI ΔrhlI株下降更明显(P＜0.05).结论 氨溴索具有拮抗密度感应系统的作用,可用于抗细菌生物膜活力,为难治性铜绿假单胞菌感染的治疗提供了新思路.     

亚苄基环戊酮介导的光动力对多重耐药铜绿假单胞菌的体外杀伤效应

目的探讨新型光敏剂亚苄基环戊酮化合物P3介导的光动力对多重耐药铜绿假单胞菌的体外杀伤效应。方法实验对象为铜绿假单胞标准菌(ATCC27853)1株和临床多重耐药菌(PA1、PA2、PA3)3株。(1)检测实验菌株与光敏剂P3的结合特性:以荧光光谱检测法检测孵育时间和孵育浓度对实验菌株与光敏剂P3结合的影响,先将4株铜绿假单胞菌与10μM光敏剂分别孵育不同时间(5、15、30、60、120和150 min),根据前期的检测结果再选择不同浓度(2. 5、5、10、25和50μM)的光敏剂P3孵育30 min。(2)观察光敏剂P3介导的PDT对铜绿假单胞菌的体外光动力抗菌效应,即PDT组(B组),按照不同浓度的光敏剂P3分为4组分别为2. 5μM(B1组)、5μM(B2组)、10μM(B3组)和25μM(B4组),药物与4种菌株的孵育时间30 min后,进行PDT处理,激光波长532 nm,功率密度40 mW/cm2,照射时间600 s,同时设立3个对照组(A组):空白对照组(A1组)、单纯照光组(A2组)和单纯光敏剂组(A3组),用稀释平板法培养24 h进行菌落计数。结果孵育时间5～30 min时,四株铜绿假单胞菌与光敏剂P3的结合量随孵育时间延长而逐渐增加;30 min后趋于饱和。浓度梯度实验结果显示,四株铜绿假单胞菌与光敏剂P3的结合量呈孵育浓度剂量依赖性增加。在相同孵育浓度和相同孵育时间条件下,四株铜绿假单胞菌与光敏剂P3的结合量未见显著差异。光敏剂P3对四株铜绿假单胞菌的PDT杀伤作用随着光敏剂P3浓度增高逐渐增强,当光敏剂P3浓度为25μM时,PDT对4株铜绿假单胞菌株均达到有效杀伤,即活性下降均4Log;光敏剂P3对铜绿假单胞标准菌和临床耐药菌的PDT杀伤效应比较,差异无统计学意义(P0. 05);单纯照光和单纯光敏剂对细菌的存活无影响。结论光敏剂P3介导的PDT对铜绿假单胞菌有良好的体外杀伤作用,其作用不受细菌耐药性的影响。     

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株pgm位点及其侧翼序列的变异,了解不同疫源地菌株间的毒力差异,为鼠疫防治提供帮助。方法比较分析现有4株菌的pgm位点及其侧翼序列的变异,采用PCR、等位基因特异性PCR扩增260株中国自然分离株和7株假结核耶尔森菌。结果除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外,其他菌株均缺失了YPl666的70～87bp之间的18bp碱基。1406bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点下游都没有IS100插入;锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有1个IS285插入,在其下游3kb区域还有1个IS100插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的pgm位点缺失,缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型,松辽平原B型,昆仑山A、B型4种生态型菌株中。结论北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支,建议归为第4个生物型——田鼠型。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点,由于在其下游没有IS100插入,所以稳定、不易缺失。pgm位点及其侧翼序列的变异与菌株的生物型、自然疫源地和生态型都具有一定的相关性。     

泰乐菌素产生菌的空间诱变育种研究

目的研究弗氏链霉菌(streptomyces fradioe)在空间条件下的变异规律,并筛选高产菌株应用于工业生产。方法将弗氏链霉菌(streptomyces fradiae)9940S^ _86连续经“神舟”1、3、4号飞船搭载进行太空诱变育种,统计筛选结果,初步探讨泰乐菌素产生菌在空间条件下的变异规律。结果复筛后得到48株效价较出发菌株提高20％以上的菌株,其中总效价最高达到14950μg／ml(摇瓶),较出发菌株提高91．5％。结论弗氏链霉菌的空间诱变受飞行时间影响较大。菌株经多次搭载后其产量变异有累积作用,并且产量变异和形态变异存在相关性。通过中试、生产实验,最终选定产量较出发生产菌株提高18％的T1—156—84—23菌株投入试生产。     

红色糖多孢菌M合成3-脱氧-3-羰基-赤酮酸内酯B的限速因子研究

目的探讨红色糖多孢菌KR6基因突变体生物合成3-脱氧-3羰基-赤酮酸内酯B（DOEB）产量显著降低的原因。方法以KR6基因突变体M菌株为研究对象,采用相对实时荧光定量RT-PCR技术、抗原-抗体检测技术和高分辨LC-MS分析技术等,分别从基因的转录水平、翻译水平以及聚酮化合物水平等层面研究了DOEB的生物合成量。结果红色糖多孢菌M菌株与出发菌株A226相比,两者聚酮合酶（PKS）基因簇在转录水平和翻译水平上的表达差异均非造成DOEB产量降低的限速因子;而DOEB的前体转化能力却大幅度降低,因此,DOEB合酶的活力降低是造成生物合成DOEB产量降低的关键因素。结论 DOEB合酶的活力是生物合成DOEB的限速因子,本研究为进一步探讨利用基因工程途径提高新酮内酯类化合物产量奠定了基础。     

糖多孢红霉菌bldD基因提高活跃链霉菌诺西肽产量的研究

目的将糖多孢红霉菌bldD基因转入活跃链霉菌（Streptomyces actuosus）N-H,探讨其对诺西肽产量的影响。方法将bldD基因连接到链霉菌整合型表达载体pZMW上构建pZMW-bldD质粒,利用PEG介导的原生质体转化方法将重组质粒pZMW-bldD及对照质粒pZMW-vgb分别导入活跃链霉菌,通过对枯草芽孢杆菌抑菌试验和分光光度计法测定发酵液中诺西肽产量。结果成功构建了活跃链霉菌N-H/pZMW-bldD工程菌株及对照菌株N-H/pZMW-vgb。与出发菌株N-H相比,N-H/pZMW-bldD菌株诺西肽产量提高了68%;与对照菌株N-H/pZMW-vgb相比,N-H/pZMW-bldD菌株诺西肽产量提高了19%。结论在活跃链霉菌中导入糖多孢红霉菌bldD基因可以提高诺西肽产量,其作用效果较vgb基因更为明显,说明bldD基因对抗生素产量的提高具有广谱性。     

红霉素3-O-甲基转移酶基因eryG克隆及表达

目的:探索红色糖多孢菌红霉素eryG基因在大肠杆菌中的最佳表达条件.方法:以红色糖多孢菌总DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b( )上,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.从诱导剂IPTG的终浓度和诱导时间两个因素来优化eryG基因的表达条件.结果:eryG基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物EryG经SDS-PAGE分析相对分子质量约为33×103.表达条件经优化后,重组蛋白EryG表达量占菌体总蛋白的55%以上.结论:红色糖多孢菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌中高效地表达,为进一步研究EryG的相关酶学性质、分析其对红霉素发酵产物的影响奠定了基础.     

红色糖多孢菌染色体基因快速失活技术研究及应用

目的：研究红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术。方法：以Thio抗性基因（tsr）作为筛选标记,在其上下游分别连接失活目的基因两侧同源片段,利用PEG介导原生质体转化将线性DNA同源片段转入红色糖多孢菌,通过tsr基因两侧同源片段与染色体同时重组,将目的基因敲除或失活。结果：tsr基因两侧同源片段长度与红色糖多孢菌染色体同源重组效率密切相关,同源片段长度在500 bp左右时,线性片段与染色体有效重组率很低,而同源片段长度超过1000 bp时,可获得有效的基因失活突变菌株。通过这种技术构建的红色糖多孢菌ΔbldD基因突变体,合成红霉素产量显著降低,说明bldD参与红霉素合成基因调控。结论：红色糖多孢菌染色体快速同源重组基因失活技术,对于分析红色糖多孢菌基因功能具有重要作用。     

产红霉素B红色糖多孢菌突变体的构建

目的：获得大量红霉素合成中间产物红霉素B,并进一步研究eryK基因的活性位点。方法：通过重叠PCR将eryK基因中包括BC环在内的关键氨基酸序列删除,克隆到同源重组质粒pWHM3上,继而通过染色体同源重组方法将EryK羟基化酶基因失活,构建了缺失C-12羟基化酶活性的红色糖多孢菌突变体。结果与结论：构建了红色糖多孢茵突变菌株AK17,对发酵产物进行TLC和MS分析,结果显示突变体主要合成红霉素B。