基于hsp65基因的PCR-RFLP用于快速鉴定分枝杆菌菌种的初步研究

目的 基于hsp65基因的PCR-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)用于快速鉴定分枝杆菌菌种的方法的建立和评价.方法 选择分枝杆菌hsp65基因作为目的 基因,对分枝杆菌标准株进行PCR扩增,扩增产物经HaeⅢ和Bstp Ⅰ两种限制性内切酶酶切,酶切产物采用4%MetaPhor琼脂糖凝胶电泳,根据电泳条带位置,计算条带分子量,确定不同菌种的特异指纹图谱.结果 共对40种(株)分枝杆菌进行分析,6株结核分枝杆菌复合体菌株呈现两种指纹图谱,34株非结核分枝杆菌标准株均具有惟一的指纹图谱.结论 基于hsp65基因的PCR-RFLP可用于分枝杆菌菌种的快速鉴定,且方法简便,易于标准化.     

吉林省乙型肝炎病毒基因型分型及临床研究

目的了解吉林省乙型肝炎病毒(HBV)的基因型流行及分布情况,探讨HBV基因型与其预防治疗的临床意义。方法采用多对型特异性引物套式聚合酶链反应(nest-PCR)对吉林省194份HBV阳性血清进行分型,并研究HBV与预防和治疗的关系。结果在194例HBV血清阳性标本中,B型16例,C型172例,B、C混合型6例,未发现其它型别的病毒。结论在吉林省HBV的基因型主要为C型,B、C混合型也占了一定比例。C型与肝硬化和肝癌关系密切,混合型与慢性肝炎关系密切。     

河北省2004～2008年乙型流行性感冒病毒监测与血凝素蛋白基因序列分析

目的了解河北省2004～2008年乙型流行性感冒（流感）病毒抗原性的变异及种系分布。方法采用狗肾传代细胞分离流感病毒,经血清学鉴定后提取病毒核糖核酸,经逆转录一聚合酶链反应扩增目的基因后,进行乙型流感病毒的血凝素重链（Heamagglutiningl HA1）基因片段的核苷酸序列测定。结果2004年10月～2008年3月,共分离到乙型流感病毒131株,其中48株为维多利亚（Victoria）系,83株为山形（Yamagata）系。2004～2005年流行期为Yamagata系毒株,2005～2006年流行期为Victoria系毒株,2006～2008年2个流行期都有Yamagata和Victoria系的毒株出现。HA2基因片段核苷酸序列测定结果显示,两个系列的毒株都有小的变异,但Yamagata系毒株变异更明显。2008年分离到的Yamagata系乙型流感病毒与2005年毒株相比已经有8个氨基酸被替代,同源性只有97．4％～98．0％。结论2004～2008年Victoria系乙型流感病毒的抗原性未发生明显的变异,但Yamagata系乙型流感病毒的基因发生变异,使抗原性发生漂移,是2007～2008年流行期引起乙型流感爆发的主要因素。     

限制性片段长度多态性分析方法应用于中国麻疹野病毒基因型别的鉴定

目的　建立和应用麻疹野病毒基因型快速诊断方法 ,及时监测麻疹流行株基因型动态 ,尽早发现异型输入病例。方法　应用一种适用于我国现流行麻疹野病毒的基因型别筛查、定型的分析方法 ,即逆转录 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性分析方法 (RT PCR RFLP) ,对吉林省 2 0 0 1～ 2 0 0 3年分离到、经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹实验室用脱氧核糖核酸 (DNA)序列分析证实为H1基因型的 9株野病毒进行验证。结果　 9株麻疹病毒分离阳性株的RT PCR-RFLP基因分型结果与核酸序列分析结果完全一致 ,均为H1基因型。并应用该方法对吉林省 2 0 0 3年分离的 2株麻疹病毒进行基因型别鉴定 ,亦为H1基因型。同时对 2 0 0 1～ 2 0 0 3年的 46份麻疹病例的临床标本 ,应用新建立的RT-PCR-RFLP方法直接进行麻疹病毒核糖核酸 (RNA)提取、RT-PCR反应及基因型别鉴定。 46例临床标本经直接RT-PCR扩增后的 31例RT-PCR阳性产物 ,经RFLP法酶切、电泳结果均为H1基因型。结论　RFLP分析方法是一种快速、简便又经济实用的中国麻疹野病毒基因定型筛查方法 ,对快速掌握麻疹病毒基因型流行动态及地理分布 ,以及麻疹野病毒的输入、变异情况 ,具有广泛应用的意义和价值     

棘阿米巴土壤分离株CB/S1的线粒体DNA限制性片段长度多态性

[目的]观察棘阿米巴土壤分离株CB/S1的线粒体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)。[方法]从棘阿米巴CB/S1提取线粒体DNA用EcoRI酶切,与土壤分离株CJY/S4比较观察限制性片段长度多态性。用地衣红-卡红染色观察棘阿米巴内共生细菌。[结果]棘阿米巴土壤分离株CB/S1线粒体DNARFLP与CJY/S4相比除了额外的片段(extra bands),两个分离株具有相同的片段模式。经地衣红染色观察CB/S1内共生细菌呈黑色、棒状、不规则的分布在胞质内。[结论]额外的片段表明棘阿米巴CB/S1内含有内共生细菌的环状DNA,并且除了内共生细菌的存在棘阿米巴CB/S1与土壤分离株CJY/S4具有密切的亲缘关系。线粒体DNA限制性片段长度多态性是棘阿米巴分类及发现内共生细菌的简便而有效的方法。     

浙江省近年H_3N_2亚型流行性感冒病毒流行株的血凝素与神经氨酸酶基因与猪型流行性感冒病毒的亲缘关系分析

目的对浙江省近年两次甲3亚型(H3N2)流行性感冒(流感)病毒流行的代表株,与猪型H3N2株流感病毒在主要抗原基因间进行比较分析,探讨二者间的亲缘关系。方法对这两次流行流感病毒代表株的血凝素(Hemagglutinin,HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因作序列测定,并与同期的人、猪流感毒株的相应基因作同源性与进化树分析。结果浙江省这两次H3N2流感流行中的代表株甲(3A3)/浙江(Zhejiang,ZJ)/10/98、A3/ZJ/6/99、A3/ZJ/8/02与猪流感病毒A3/猪型(SW)/安大略(Ontario,ON)/130/97、A3/SW/香港(Hongkong,HK)/4361/99、A3/SW/HK/74/02在HA1区的同源性,分别为99.1%、99.4%、99.4%;在NA区,A3/ZJ/10/98、A3/ZJ/6/99、A3/ZJ/8/02与猪流感病毒A3/SW/ON/130/97、A3/SW/HK/4361/99、A3/SW/HK/74/02的同源性,分别达到98.2%、99.3%、99.3%。二者之间均呈现出很高的同源性,有的远高于它与同期人流感毒株的同源性,在基...     

贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎病毒分子生物学特征

目的研究贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎(脊灰)病毒分子生物学特征。方法对贵州省2004年分离到的所有脊灰病毒,用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行了型内鉴定,并对型内鉴定异常株进行了VP1区的序列测定。结果贵州省在2004年急性弛缓性麻痹(AFP)病例及接触者、流动人口和健康儿童的粪便标本中,共有95例分离到脊灰病毒。其中Ⅰ型22例,Ⅱ型26例,Ⅲ型21例,混合型19例,脊灰病毒混合非脊灰肠道病毒7例。经用PCR-RFLP和ELISA方法进行型内鉴定,共有16株病毒与疫苗株病毒存在差异,其中3株脊灰病毒与疫苗株病毒在PCR-RFLP图谱上有差异[其中1株同时为双反应(DRV)],3株ELISA结果为DRV,11株ELISA结果为非疫苗类似株(NSL)。在这些型内鉴定异常株病毒中,Ⅰ型13株,Ⅱ型3株。对这16株脊灰病毒进行VP1区序列测定,发现9株Ⅰ型疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)和1株Ⅱ型VDPV。结论根据对贵州省2004年从95例AFP病例及接触者、流动人口、健康儿童分离的脊灰病毒的血清定型结果和型内鉴定结果及对13株Ⅰ型和8株Ⅱ型脊灰病毒VP1区核苷酸序列测定证实,脊灰减毒活疫苗病毒在人群的循环导致疫苗病毒神经毒力恢复突变。通过AFP病例监测系统及时发现了Ⅰ型VDPV的循环和Ⅱ型VDPV。对2004年下半年脊灰病毒基因特点的分析,提示贵州省已经阻断了Ⅰ型VDPV的循环。     

浙江省近几年甲3亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因分析

目的通过浙江省1998~2005年甲3亚型流行性感冒(流感)病毒的神经氨酸酶(NA)基因的序列比较,阐明近几年NA基因的变异与流感流行的关系。方法对浙江省1998~2005年流感流行期间分离的甲3亚型流感代表性毒株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因,进行核苷酸序列测定,并用Bio-Edit软件作分析处理。结果浙江省近几年流感流行期间分离到甲3亚型流感病毒代表株13株,其NA基因核苷酸长度均为1 338bp,由此推导的氨基酸数为446个。1998~2005年甲3亚型流感病毒在NA基因区发生可遗传的氨基酸变异达22个,其中1998~1999年、1999~2002年变异最大,均达到9个氨基酸的差异;2003年后病毒的变异趋向平稳,这与NA基因系统进化树的结果相一致。此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异,而在2003年后的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间的符合程度较好。结论近年来浙江省甲3亚型流感病毒的NA区域与血凝素区域相似,均发生了较大的抗原性漂移,提示1999~2005年发生的2次流感流行是由于当年的甲3亚型流感分离株变异影响到病毒的抗原性所导致的。     

中国居民血管紧张素转换酶基因多态性与冠心病易感性关系的荟萃分析

目的综合评价血管紧张素转换酶（ACE）基因插入和（或）缺失（insertion／deletion,I／D）多态性与冠心病易感性的关系。方法用关键词途径搜索了Medline光盘数据库（1994年1月至2005年2月）和中国医院知识仓库（CHKD）中文期刊全文库（1994年1月至2005年5月）,搜集所有研究ACE基因多态性与冠心病易感关系的病例对照研究,应用RevMan 4．2软件对各研究结果进行异质性检验和数据合并。结果共有16篇符合条件的文献纳入分析,累积病例1345例,累积对照1286例。同杂合子（DI）和（或）纯合子插入型（Ⅱ）基因型相比,DD（纯合子缺失型）基因型冠心病的发病风险高出156％（OR=2．56,95％CI为2．09～3．13）;ACE D等位基因与冠心病关系的趋势性检验结果表明,随着D等位基因的增多发生冠心病的危险性也随之增大（xTrend^2=97．12,P〈0．01）。结论ACE基因多态性可能与我国人群冠心病的易感性相关,DD基因型个体冠心病的发病风险明显增高,冠心病发病风险与D等位基因密切相关。     

江西省流行性乙型脑炎病毒的分离与鉴定

目的调查江西省的虫媒病毒分布状况,在当地采集蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2008-2009年夏季在江西省共选择8个标本采集点,使用诱蚊灯采集蚊虫标本,通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定;利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析。结果 2008年采集到3属3种共计11916只蚊虫标本;2009年采集到4属5种共计5905只蚊虫标本;共分离到4株病毒,经鉴定均为流行性乙型脑炎(乙脑)病毒;新分离乙脑病毒与基因Ⅰ型乙脑病毒的同源性最高,系统进化结果显示,4株乙脑病毒均属于基因Ⅰ型。结论在江西省分离到基因Ⅰ型乙脑病毒,与上海市和浙江省分离株进化关系较近。     

应用PCR-RFLP技术进行乙型流感病毒鉴别的实验研究

目的:应用聚合酶链反应(PCR)连接的限制性片段长度多态性(RELP)技术进行乙型流感病毒及其巴拿马株与维多利亚株两大谱系的鉴别。方法:根据GenBank中登录乙型流感病毒血凝素(HA)区域的核苷酸序列,应用软件进行序列比对,根据HA基因的保守区设计、筛选引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增流感病毒HA基因,用限制性内切酶H indⅢ酶切扩增产物并进行琼脂糖凝胶电泳,同时对检测方法进行特异性和灵敏性实验。结果:该方法对乙型流感病毒有特异性,与甲1和甲3型流感病毒无交叉反应。维多利亚株和巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,扩增产物经H indⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603 bp与242 bp的两个可见片段,而维多利亚株因无H indⅢ酶切位点,仍呈872 bp的一个片段。该方法检测敏感度可达0.1 TC ID50。结论:该方法是一种灵敏度高、特异性强的乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株鉴别的方法。     

用PCR/RFLP技术对黑龙江沿岸蜱类和鼠类中北亚蜱传斑点热的检测

为了解黑龙江沿岸部分地区斑点热自然疫源地存在情况，作者用PCR／RFLP的方法检测该地区蜱类及鼠类中的斑点热群（spottedfevergroup，SFG）立克次体。结果从该地区的森林革蜱、嗜群血蜱、黑线姬鼠、东方田鼠、麝鼠及棕背中均扩增出了斑点热群立克次体的特异片段，而对斑疹伤寒立克次体、恙虫病立克欢体、Q热立克次体则为阴性。PCR产物经PstⅠ及RsaⅠ酶切后发现它们的酶切图谱与西伯利亚立克次体完全相同，而有别于其它斑点热群立克次体标准株。作者认为黑龙江沿岸调查点可能存在北亚蜱传斑点热的自然疫源地。     

利用限制性片段长度多态性分析检测乙醛脱氢酶基因2的基因型

人类摄入酒精主要通过Ⅰ型酒精脱氢酶和乙醛脱氢酶共同催化。为建立乙醛脱氢酶基因２（ＡＬＤＨ２）的基因型检测方法，本研究应用限制性片段长度多态性分析法（ＲＦＬＰ－ＰＣＲ）测定ＡＬＤＨ２的基因型。根据ＡＬＤＨ２的基因序理资料，设计一含一个碱基替代的限制性内切酶ＭｂｏⅡ的可识别位点。随后ＤＮＡ模板在下列条件扩增；变性；９４，１ｍｉｎ，退火；５７℃，３ｍｉｎ，延伸；７２℃１ｍｉｎ。３５个循环。聚合酶链反应产     

AFLP技术及其应用

介绍扩增的片段长度多态性技术及其在分子流行病学中的应用，对近年来ＡＦＬＰ技术在几种病原菌的应用进行综述，并与其它分子流行病学方法进行比较。ＡＦＬＰ具有其它基因指纹图谱方法的优点，并且相对快速、简便，结果可重复，分辨力高。ＡＦＬＰ是一种基于ＰＣＲ的高分辨ＤＮＡ指纹方法，必将广泛应用于微生物的分型与鉴定。     

广东省1991-2004年乙型流感监测结果分析

[目的]分析1991—2004年广东省乙型流感病毒抗原变异和流行情况。[方法]用9~11日龄鸡胚和(或)MDCK细胞分离流感病毒,病毒鉴定用常量红细胞凝集抑制法(HI);人血清流感抗体检测用微量半加敏红细胞凝集抑制法。[结果]广东省一直有乙型流感流行,并从人群中分离到流感病毒2 916株,乙型流感病毒占23.3%。乙型流感病毒两大谱系交替为优势株,除1994、1997及2002年以Victoria系为主外,其余各年以Yamagata系为主。乙型流感病毒抗原性不断发生漂移,历年一般人群血清乙型流感抗体检测阳性率在28.3%~73.9%。[结论]1991—2004年广东省乙型流感病毒存在差异较大的两个谱系,病毒谱系的轮换和抗原漂移导致乙型流感不断流行。     

2000-2003年广东省流感监测结果分析

[目的]了解广东省流感流行情况,为预防和控制提供科学依据.[方法]在8个流感监测点采集疑似流感病人的咽拭子,一般人群及职业人群采集血清,用9～11 d鸡胚和(或)MDCK细胞分离病毒,用常量红细胞凝集抑制法(HI)鉴定病毒;用微量半加敏红细胞凝集抑制法(micro-HI)检测流感抗体.[结果]2000、2001年流感疫情较平静,2002、2003年由A(H3N2)引起的局部暴发增多,未发生大流行.4年共分离流感病毒1 425株,A(H3N2)占61. 2%、B型占27.0%、A(H1N1)占11.8%;从鸡标本分离A(H9N2)型禽流感病毒17株.一般人群血清A(H3N2)抗体阳性率较高,B(Yamagata)型较低;职业人群部分A(H9N2)禽流感抗体阳性.[结论]除2003年未分离到A(H1N1)外,2000-2002年都能同时分离到A(H1N1),A(H3N2)亚型和B型.做好流感监测对控制流行与预测有重要意义.     

2006年河北省新分离Victoria系B型流感病毒变异株血凝素基因序列分析

目的分析2006年河北省分离的B型流感毒株HA抗原性和基因特性,阐明HA基因的变异与流感流行的关系。方法用MDCK(Madin Darby Canine Kidney)细胞分离培养流感病毒,血凝抑制(Hemasslutination Inhibition,HI)试验鉴定型别。提取病毒核糖核酸(RNA),采用RT-PCR扩增病毒HA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理。结果2006年在河北省流行的B型流感病毒属Victoria系,与北半球该流行期的国际疫苗株B/上海/361/02不同,其抗原性与最近的Victoria系代表株B/Hong Kong/330/2001相比已发生较大变异,核苷酸同源性仅为96.5%～97.2%,在抗原决定簇上有6个位点发生了氨基酸替换。结论2006年在河北省流行的Victoria系B型流感病毒是一个新的变种,在HA1区域发生的变异是今年B型流感流行的主要原因,应该引起重视。     

一起学校乙型流感暴发的流行病学研究

目的研究大庆市某一学校中乙型流感暴发有关的流行病学。方法借助描述性流行病学方式对大庆市某一学校中乙型流感暴发有关的流行病学进行分析与研究,观察其结果。结果疫情在第15日病例总数十分迅速地得到升高,在第18日到了最高峰,在第21日回至低位,末例在第25日。采集咽拭子并对其就乙型流感病毒进行检测,体温高于38℃的总阳性率共70.00%;对血清乙型流感IgM抗体进行检测,体温高于38℃的总阳性率共90.00%,体温低于38℃的总阳性率共70.00%,没有症状的总阳性率共20.00%。结论在乙型流感出现暴发与流行的时间曲线中,在其暴发前期需要共2个最长的潜伏期,在暴发期、后期中都需要共3个最长的潜伏期;血清乙型流感IgM抗体与患者体温的高低间体现为正向的关系。     

玉溪市2009年流感监测分析

目的了解玉溪市流感流行动态,揭示玉溪市流感流行及病原学的变化,为更好地做好流感预防控制工作。方法按全国流感监测方案,对暴发疫情和哨点医院采集流感样病例咽拭子标本,用Real-time RT-PCR方法检测。结果 2009年玉溪市流感网络实验室共检测流感样病例标本980份,甲型H1N1核酸阳性143份,阳性率14.59%,甲型H1阳性11份,阳性率1.33%;甲型H3阳性80份,阳性率8.16%;B型核酸阳性6份,阳性率0.61%。结论玉溪市的流感病原,季节性H1、H3、B型和甲型H1N1流感同时存在,但甲型H1N1逐步成为流行的优势毒株。