p63在侧腭突MEE／MES消失过程中的作用机制

目的：探讨p63及其亚型ANp63、TAp63在正常胎鼠和腭裂模型胎鼠侧腭突上皮，特别是在胚胎腭中线上皮（medialedgeepithelial，MEE）／胚胎腭中线上皮带（medialepithelialseam，MES）中的表达及变化情况，阐明p63及其亚型△Np63、TAp63在MEE／MES消失过程中的作用。方法：建立全反式维A酸（all—transretinoicacid，atRA）诱导的胎鼠腭裂模型，实验组在鼠孕期第10天（gestationday，GD10）按100mg，kg给予atRA灌胃，对照组则给予同等剂量的玉米油．分别在GD13．5、GD14．5、GD15．5、GD16．5解剖取得胎鼠的腭突，通过HE染色、扫描电镜进行形态学观察，采用免疫组化方法检测胎鼠侧腭突上皮p63、ANp63及TAp63的表达。结果：在GD14．5，对照组p63和ANp63在侧腭突MEE细胞内基本呈阴性表达．而实验组则呈阳性表达。在GD15．5．对照组MEE／MES消失，腭突基本融合，侧腭突所有被覆上皮基底层细胞再次出现p63和△NF．63阳性表达；实验组MEE／MES则未完全消退，p63和ANp63在消退异常的MEE细胞内仍呈阳性表达。在GD16．5对照组，腭突融合完成，侧腭突被覆上皮基底层细胞p63和△Np63仍呈阳性表达；而实验组未融合，呈腭裂，p63和△Np63在MEE细胞内呈阴性表达。结论：在胎鼠侧腭突上皮发育过程中，存在p63及其亚型ANp63特定时空的差异表达，提示ANp63参与侧腭突上皮的分化调控，尤其是参与了MEE／MES消失过程中的信号调控．     

p21Waf1/Cip1蛋白在侧腭突MEE/MES消失过程中的表达及意义

目的:探讨p21 Waf1/Cip1(p21)蛋白与调控p21的相关蛋白Jag1、Jag2、Notch1在正常胎鼠和腭裂模型侧腭突胚胎上皮,特别是胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带中的表达及变化,初步研究p21蛋白在胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带消失过程中的作用。方法:实验组为全反式维A酸(all-trans retinoic acid,at RA)诱导建立的C57BL/6J胎鼠腭裂模型,对照组用同等剂量玉米油喂养孕鼠。在鼠孕期第13.5天(gestation day,GD13.5)、GD14.5、GD15.5、GD16.5解剖取得胎鼠腭突,吖啶橙染色观察腭突形态,免疫组织化学染色检测p21与Jag1、Jag2、Notch1在胎鼠侧腭突上皮的表达。结果:实验组Jag1、Jag2、Notch1、p21在各个时间点均呈阴性表达。在GD14.5、GD15.5,对照组Jag1、Jag2、Notch1、p21在胚胎腭中线上皮带细胞内均有阳性表达。在GD15.5,对照组胚胎腭中线上皮带消失,腭突基本融合;实验组则胚胎腭中线上皮细胞未消退,形成腭裂。在GD16.5,Jag1、Jag2、Notch1在侧腭突所有被覆上皮仍有阳性表达,p21仅在鼻腔侧有微弱阳性表达。结论:在胎鼠侧腭突发育过程中,存在Jag1、Jag2、Notch1、p21特定时空的差异表达。结合前期试验,提示p21参与侧腭突上皮的凋亡与分化,尤其参与了ΔNp63在胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带消失过程中的作用。     

全反式维甲酸对C57小鼠胚胎腭突Bmpr-1b表达的影响

目的探讨维甲酸对不同时期小鼠胚胎腭突区Bmpr-1b表达的影响。方法采用100mg/kg全反式维甲酸(atRA)在C57BL/6N近交系孕鼠妊娠第10天(GD10)给予灌胃,对照组纯玉米油灌胃。GD13、GD15、GD17时取出胚胎并暴露胎鼠腭突,进行苏木精-伊红(HE)染色,并对3个时期的胚胎腭样本进行免疫组织化学染色,检测Bmpr-1b在不同组内小鼠胚胎腭突组织内的表达。在GD15和GD17时按照上述方法取孕鼠的胚胎腭部组织进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bmpr-1b的mRNA表达。结果 HE染色观测发现实验组腭突没有在中线处融合,形成体积较小的畸形腭突和明显的中缝腭裂,成骨中心区范围明显小于对照组。免疫组织化学检测发现,Bmpr-1b的表达与腭突间充质组织的生长发育呈正相关。GD13～GD17期间实验组小鼠发育中的腭突间充质中Bmpr-1b的阳性指数得分均少于对照组。GD17时期实验组小鼠腭突间充质组织的骨组织支架面积小于对照组。RT-PCR结果显示,GD17时期Bmpr-1b的mRNA表达水平均显著高于GD15。在同一时间点内,对照组的Bmpr-1b的表达水平显著高于实验组。结论对GD10 C57BL/6N母鼠进行atRA灌胃可导致胎鼠腭突区Bmpr-1b的表达水平明显下调,腭突发育不良,腭部骨骼形成进程都受到抑制,最终形成小腭突畸形。     

bcl-2在腭裂胎鼠中间嵴上皮细胞的表达及意义

目的研究地塞米松诱导的腭裂模型中腭突中间嵴上皮细胞（MEE）的变化及bcl-2基因表达,探讨MEE细胞凋亡与腭裂的关系。方法孕鼠随机分为实验组和对照组。实验组在11．5孕期13腹腔注射地塞米松,对照组注射等量生理盐水。分别于12．5、13．5、14．5、15．5、16．5孕期日（GD）处死,胎头石蜡包埋,切片,行HE和免疫组化染色。结果MEE细胞的形态变化：实验组和对照组12．5、13．5GD MEE细胞均为复层上皮,基底层细胞为立方形,表层覆以扁平细胞。对照组14．5GD MEE细胞在中线融合消失,实验组14．5～16．5GD MEE细胞继续生长变为多层,形成腭裂。免疫组化显示：12．5,13．5GD实验组和对照组MEE细胞的bcl-2表达无明显差别;实验组14．5GD MEE细胞bcl-2阳性信号明显强于对照组;15．5、16．5GD的阳性信号继续增强,而对照组MEE细胞消失。结论地塞米松可以通过影响bcl-2基因的表达,抑制MEE细胞凋亡,最终导致腭裂。     

程序性细胞死亡在小鼠腭突发育及腭裂形成中的意义

目的:明确程序性细胞死亡在腭裂形成中的作用。进一步探讨调控程序性细胞死亡的相关基因在腭裂形成中的变化及分子生物学机制。方法:将16只妊娠10d(GD10)的C57BL/6N系小鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲维甲酸80mg/kg,对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,GD168d处死孕鼠取胚鼠。胚鼠头部切片做原位末端转移酶标记(TUNEL)染色。结果:在腭突垂直生长期及定向移动期,两组腭间质细胞发生程序性死亡的数量有明显的差异(P<0.05)。结论:经外源性维甲酸作用后的小鼠腭突间质细胞发生大量程序性死亡,腭突体积发育瘦小,未能在中线相互融合而导致腭裂。     

腭裂相关基因mcpr1在小鼠腭突发育及腭裂发生中的表达研究

目的检测mcpr1基因的蛋白在正常腭突及小鼠腭裂模型腭突发育中的时空表达模式。方法实验组管饲含全反式维甲酸的植物油诱导建立小鼠腭裂模型,对照组小鼠管饲植物油。2组取胎龄12、13、14、16 d的胎鼠各3只,包埋切片,HE染色观察2组胎鼠腭部发育的形态学变化,免疫组织化学方法观察MCPR1蛋白在2组胎鼠腭突中的表达差异。结果成功建立小鼠腭裂模型。切片HE染色观察发现实验组双侧腭突体积较对照组小,两侧腭突未接触;而对照组腭突融合,腭骨形成。免疫组织化学检查结果表明对照组小鼠胎龄12 d时MCPR1蛋白在腭突上皮细胞呈强阳性表达;而实验组小鼠胎龄12 d时腭突间充质细胞内MCPR1蛋白的表达较强,实验组胎龄16 d小鼠仅在上皮细胞附近的间充质细胞中有阳性表达。同一时间点比较,MCPR1蛋白的表达在实验组均强于对照组（P〈0.05）。结论 MCPR1蛋白的表达变化随腭部发育存在时空表达差异。     

地塞米松在诱发先天性腭裂发病中对表皮生长因子受体表达的影响

目的　检测地塞米松诱发 NIH小鼠先天性腭裂时对表皮生长因子受体 ( EGFR)表达的影响。方法　在 GD12 1 2天小时给怀孕小鼠腹腔注射磷酸地塞米松注射液 ( 5 0 mg/kg) ,对照组则以等量生理盐水代替。分别于GD13 1 2 、GD14 1 2 、GD15 1 2 天小时 取出胎鼠头部标本 ,作冠状位切片。采用免疫组化方法检测胚胎腭中 EGFR的表达。结果　 EGFR的表达随胚胎腭的发育而增高 ,实验组 EGFR增高的速度较慢。结论　地塞米松诱发先天性腭裂发病与 EGFR表达的改变有关     

骨形态发生蛋白受体2在维甲酸诱导腭裂小鼠胚胎腭突中的表达

目的 探讨全反式维甲酸（atRA）对小鼠胚胎腭突中骨形态发生蛋白受体 2（BMPR2）表达的影响。方法 通过 atRA灌胃的方法建立 atRA诱导的小鼠腭裂模型,取妊娠 15 d（GD15）和 17 d的（ GD17）的胚胎腭部进行苏木精-伊红染色,并用免疫组织化学及逆转录聚合酶链式反应技术检测 BMPR2在胚胎腭部的表达。结果 atRA诱导小鼠形成体积较小的畸形腭突和明显的中缝腭裂畸形。 BMPR2在GD15和GD17正常胚胎腭部有高水平的阳性表达,但在腭裂胚胎腭部的表达水平明显减弱。正常胚胎腭部 Bmpr2 mRNA在GD15和GD17的表达水平均明显高于腭裂胚胎（ P<0.05）。结论 atRA可导致小鼠胚胎腭突发育不良形成腭裂,并显著下调 BMPR2表达水平,从而影响腭部发育的正常分子调控过程。     

atRA对C57BL/6N小鼠腭突间充质细胞周期分布的影响及其作用机制

目的：在全反式维A酸（all-trans retinoic acid,atRA）诱导建立腭裂小鼠模型的基础上,检测胎鼠体内胚胎腭突间充质细胞的周期分布,并检测相关周期蛋白的变化情况,为进一步阐明维A酸（retinoic acid,RA）诱导腭裂机制提供新的线索。方法：以atRA建立C57BL/6N胎鼠腭裂模型,采用流式细胞术及免疫组化检测小鼠胚胎腭突间充质细胞的周期分布,通过实时定量RT-PCR和Western印记法检测p21和pRb在胎鼠胚胎腭突间充质中的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。结果：流式细胞术及免疫组化检测发现,在小鼠妊娠日（gestation day,GD）第10天时给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭突间充质细胞在一定妊娠阶段出现G1期细胞周期阻滞,同时也使胎鼠胚胎腭突间充质内p21和pRb的表达水平出现改变。而妊娠第12天（GD12）时给予atRA则无此现象。结论：p21与pRb参与了GD10时给予atRA诱导组胎鼠胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞的发生。     

TCDD和B6 联合作用下小鼠腭板形态的扫描电镜观察

目的：二恶英（TCDD）和维生素B。联合作用下小鼠腭板形态的扫描电镜观察。方法：对孕期10d（GD10）的小鼠,分别胃饲TCDD24μg／kg,5mg、10mg、20mgB6／kg＋TCDD24μg／kg,对照组胃饲芝麻油50ml／kg,然后分别在GD12．5、GD13．5、GD14．5、GD15．5和GD17．5处死孕鼠,检查GDl7．5胎鼠有无腭裂的发生,GD12．5、GD13．5、GD14．5、GD15．5胎鼠用于扫描电镜观察。结果：TCDD组的腭裂发生率为55．56％,对照组未见腭裂发生,TCDD＋B6组浓度梯度下腭裂发生率为31．81％（5mg）,44．44％（10mg）,40．90％（20mg）。扫描电镜对照组腭中嵴上皮细胞形态规整,有大量微丝,伪足,随着孕期增加,融合的进行,微丝,伪足逐渐消失。TCDD组细胞肿胀变形,表面光滑,未见微丝,和伪足,而且形态并不随孕期的延长而改变,B6组腭中嵴上皮完全消失和TCDD组类似。结论：维生素B6不能恢复小鼠腭中嵴上皮细胞的表面超微结构,从而无法逆转TCDD导致腭裂效应。     

C57BL/6N系小鼠腭裂模型的建立及扫描电镜观察

观察腭裂形成过程及腭突正常发育中形态发生、组织学变化。方法１６只妊娠１０天的Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系小鼠随机分为实验组、对照组、于ＧＤ１３＾１４,（１３ｄ１４ｈ略写为３＾１４以下类同）,ＧＤ１３＾３２,ＧＤ１４＾８,ＧＤ１４＾２２,ＧＤ１５＾８,ＧＤ１５＾２２,ＧＤ１６＾８剖腹取鼠头部标本分别做扫描电镜及ＨＥ染色。     

Cleft palate formation after palatal fusion occurs due to the rupture of epithelial basement membranes

2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) induces cleft palate and hydronephrosis in the mouse embryo. Cleft palate occurs due to failure in palatal grow, but the underlying mechanisms are unclear. We investigated the mechanisms of cleft palate development in TCDD-exposed mouse embryos. We administered olive oil (control group) or TCDD diluted in olive oil (40 μg/kg) via gastric tubes to pregnant mice on gestational day (GD) 12. Embryos of control and TCDD-exposed groups were removed from pregnant mice on GD 14 and GD 15, respectively. One mouse embryo from the control group had anteroposterior palatal fusion. Palatal fusion was observed in three TCDD-exposed mouse embryos. Palates of TCDD-exposed mice fused from the interior to the middle of the palates, while the palates were separated in the posterior region. The middle of the embryonic palatal shelves in TCDD-exposed animals was narrow and split at the fusional position. At this position, palatal and blood cells were dispersed from the palatal tissue and the epithelium was split, with a discontinuous basement membrane. The results suggest that decreased intercellular adhesion or insufficient tissue strength of the palatal shelves may be involved in the development of cleft palate following palatal fusion.     

还原型谷胱甘肽稳态在腭裂发生中的作用

目的： 观察还原型谷胱甘肽稳态的改变对腭中嵴上皮细胞形态及腭裂发生率的影响,探讨氧化自由基在四氯二苯二噁英（TCDD）致畸过程中的作用。方法： 将GD10的SPF级C57BL/6J孕鼠随机分为4组,TCDD组：腹腔注射生理盐水和TCDD灌胃;TCDD+丁硫氨酸-亚砜胺(BSO)组：腹腔注射BSO 4 h后给予TCDD灌胃;BSO组：腹腔注射BSO和玉米油灌胃;对照组：腹腔注射生理盐水和玉米油灌胃。光学显微镜和电子扫描电镜下观察胎鼠腭胚突的发育及细胞表面形态。统计各组小鼠在GD17的腭裂发生率。免疫组织化学方法检测各组腭中嵴上皮各时期CYP1A1蛋白的表达。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计分析。结果： TCDD成功构建高致畸率的腭裂模型。BSO增加了5%的腭裂发生率,但是相对于TCDD组无显著差异(P>0.05)。TCDD组腭胚突上抬时间较对照组推迟1 d,添加BSO的TCDD组腭胚突上抬过程较正常组减慢。电镜下胚胎发育的各发育时期,腭中嵴上皮表面TCDD组与对照组有显著差异。免疫组织化学检测发现,TCDD组腭中嵴上皮可见CYP1A1高表达。结论： 扰乱体内还原型谷胱甘肽稳态,可能会减少对小鼠体内氧化自由基的消耗,从而影响腭胚突的融合,继而加速了TCDD的毒性,影响腭裂发生。     

地塞米松诱导小鼠腭裂及E-钙黏素基因表达的研究

目的 建立地塞米松（DEX）诱发 C57BL/6J小鼠的腭裂模型,并在腭发育期间检测E-钙黏素基因的表达,探讨DEX诱发腭裂与E-钙黏素基因的相关性。方法 将孕鼠随机分为实验组和对照组,在小鼠E10.0—E12.0,连续3 d按体重分别给予孕鼠注射DEX（实验组）和生理盐水（对照组）,于E17.5在体视显微镜下检测各组腭裂的发生率;分别在E13.5、E14.5、E15.5、E17.5取胎鼠腭部组织行苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学染色,观察腭部形态及E-钙黏素的表达情况;在E14.0、E14.5、E15.5时采用实时荧光定量聚合酶链反应检测2组腭突中E-钙黏素以及β-钙黏素 mRNA的表达水平。结果 DEX组腭裂发生率为43.59%（17/39）,对照组为3.03%（1/33）。DEX作用后,腭突体积明显缩小,上皮不能接触,E-钙黏素阳性表达于腭突间充质中。在E14.0、E14.5及E15.5,与对照组相比,实验组腭突E-钙黏素及β-钙黏素的表达均升高（P<0.05）。结论 DEX处理后,E-钙黏素在腭突间充质中异位表达,其基因表达上调,与其相结合的β-钙黏素表达量也增多,影响了间充质的增殖从而形成短小腭突导致腭裂。     

Expression and function of patatin-like phospholipase domain-containing 2 in cleft palate induced by retinoic acid

Cleft palate is a common maxillofacial congenital malformation, and its mechanism still has not been fully illustrated. Recently, lipid metabolic defects have been observed in cleft palate. Patatin-like phospholipase domain-containing 2 (Pnpla2) is an important lipolytic gene. However, its effect on the formation of cleft palate remains unknown. In this research, we explored the expression of Pnpla2 in the palatal shelves of control mice. We also studied mice with cleft palates induced by retinoic acid and its effect on the embryonic palatal mesenchyme (EPM) cells phenotype. We found that Pnpla2 was expressed in the palatal shelves of both the cleft palate and control mice. Pnpla2 expression was lower in cleft palate mice than in the control mice. Experiments with EPM cells showed that knockdown of Pnpla2 inhibited cell proliferation and migration. In conclusion, Pnpla2 is linked to palatal development. We have indicated that low expression of Pnpla2 affects palatogenesis by inhibiting the proliferation and migration of EPM cells.     

组蛋白去甲基酶UTX在2，3，7，8-四氯二苯并二噁英诱导胎鼠腭裂模型中的作用机制初步研究

目的    初步研究组蛋白去甲基酶UTX在2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）诱导胎鼠腭裂模型中的作用机制。方法    选取18只C57BL/6J孕鼠随机分为TCDD组和对照组,每组9只。在妊娠第10.5天,TCDD组孕鼠采用经口灌胃方式一次性给予64 μg/kg的TCDD（溶于0.2 mL的玉米油中）,对照组采用经口灌胃方式给予0.2 mL玉米油。每组分别于妊娠第13.5、14.5、15.5天各安乐处死3只孕鼠,分离胎鼠腭突组织。采用HE染色观察腭突组织形态,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot检测两组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白表达水平。结果    HE染色结果显示,妊娠第15.5天对照组胎鼠双侧腭突组织已接触融合;而TCDD组胎鼠腭突组织未融合,且舌体下降出现明显延迟,提示腭裂初步形成。在不同妊娠时间,两组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白相对表达量均有变化（F值分别为28.683、7.927,均P < 0.05）;TCDD组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组（F值分别为1167.309、348.274,均P < 0.05）;且两组UTX的mRNA相对表达量差异随着妊娠时间的延长而变大（F = 4.885,P = 0.017）,而两组UTX蛋白相对表达量的差异随妊娠时间的延长无明显变化（F = 3.158,P = 0.061）。结论    胎鼠腭突组织中UTX的表达水平降低可能是TCDD诱导腭裂发生的主要原因之一,UTX可能在腭部发育过程中具有重要作用。