自身抗原gp210融合蛋白的重组表达及其临床应用研究

目的 重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的临床诊断和病情监测。方法 针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a（＋）,构建重组表达载体PET28a（＋）-gp210,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋白,进一步经Ni2＋亲合层析柱纯化。应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体。结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a（＋）-gp210重组质粒。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白。经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异（P〈0.05）。PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关。结论 应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据。     

核包膜蛋白gp210自身抗原基因的克隆、表达、纯化及其临床应用

目的研究核包膜蛋白gp210基因在大肠杆菌中的稳定表达、纯化和免疫学活性鉴定。方法从人外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增gp210蛋白中含优势表位的基因片段。将该段基因克隆入PET-30a表达载体并转化到大肠杆菌BL21中表达。融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE电泳及ELISA方法进行鉴定。结果在原核表达载体中成功构建了PET30a-gp210重组体。重组体诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子量大约69 kD处有gp210融合蛋白的高效表达,经纯化获得纯度达90%的表达蛋白。ELISA检测结果显示该重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论应用基因工程方法,获得了gp210重组蛋白,为检测抗gp210抗体提供了特异性抗原,也为临床将抗gp210抗体作为PBC的特异性诊断指标奠定了基础。     

对《核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探》一文的商榷

编辑同志： 贵刊2005年第11期刊登了李永哲等《核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探》一文，在阅读过程中，发现有些表述欠妥，特提出与作者商榷。     

利用重组人源靶抗原二联体OP检测M2抗体及临床意义

目的 利用重组抗原检测自身免疫病患者血清中抗OP自身抗体并探讨其临床意义。方法 经Ni-NTA柱纯化表达重组OP融合蛋白作为抗原，分别用免疫印迹法（IBT）和酶链免疫吸附试验（ELISA）检测70份PBC患者血清，80份其它肝病患者血清，80份自身免疫病患者血清和100份正常人血清。结果 70份PBC患者血清中检测出阳性患者62例，阴性8例，阳性率为87．6％。其它肝病患者血清、自身免疫病患者血清和正常人血清均为阴性。重组抗原检测M2抗体有一定的敏感性。结论 利用重组抗原OP检测M2抗体，有较好的敏感性及特异性，有助于PBC的临床诊断。     

巨细胞病毒gp27蛋白表达及其ELISA方法的建立

目的构建高表达巨细胞病毒（CMV）gp27蛋白的重组质粒及工程菌,获取纯化的gp27蛋白抗原。方法采用PCR技术,克隆表达CMV gp27重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法,鉴定其抗原性。结果表达纯化的gp27蛋白纯度〉95%,经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测50份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和30份阴性血清,捕获ELISA法阳性检出率98.0%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;其中1份CMV-IgM阳性血清1∶32稀释后仍能与抗原反应,表明gp27蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。结论高效表达纯化的gp27蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测巨细胞病毒抗体。     

抗gp210及sp100抗体在原发性胆汁性肝硬化患者中的临床研究

目的 探讨抗gp210、sp100抗体检测在原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者的相关性及临床意义.方法 53例原发性胆汁性肝硬化及168例非原发性胆汁性肝硬化（非PBC）患者及50例健康对照采用免疫印迹法检测抗gp210和sp100自身抗体并观察其临床评价指标,对其结果进行回顾性分析.结果 （1）53例PBC患者采用免疫印迹法检测gp210和sp100等自身抗体结果显示其阳性率分别为41.5％和17.0％;与菲PBC和对照组比较,P＜0.01有非常显著性意义.（2）53例PBC患者检测gp210和sp100等自身抗体与非PBC及对照组比较,其临床评价指标结果显示敏感性为41.5％和17.0％o,特异性为97.2％和99.5％.结论 PBC患者检测抗gp210和抗sp100抗体,对PBC的诊断及治疗具有重要的作用,有助于提高PBC诊疗水平.     

M2抗体重组人源靶抗原二联体在原发性胆汁性肝硬化患者中的检测及应用

目的 利用重组抗原BCOADA-E2和PDC-E2的二联体（BP），检测PBC患者血清中的M2抗体并探讨其临床意义。方法 经Ni—NTA亲和柱纯化重组表达的BP融合蛋白，分别建立免疫印迹法（IBT）和酶链免疫吸附（ELISA）法检测60份PBC患者血清，以60份其他肝病患者、60份自身免疫病患者、80例正常人血清为对照组。结果 经常规试剂盒检测为M2（＋）的60份患者血清，利用重组抗原检测阳性53例，阴性7例，阳性率为88．3％；经常规试剂盒检测为M2（-）的60份自身免疫病患者血清、60份其他肝病患者和80例正常人血清，利用重组抗原检测为M2（-）。结论 利用重组抗原BP检测M2抗体敏感性较高。对临床辅助诊断PBC提供一定的手段。     

严重急性呼吸道综合征冠状病毒Spike蛋白抗原特异性的临床应用研究

目的 探讨严重急性呼吸道综合征（SARS）患者的SARS冠状病毒（SARS—CoV）抗体产生情况以及SARS-CoVSpike蛋白抗原的特异性。方法 运用酶联免疫法（ELISA）和蛋白质印迹法（WesternBlotting）检测95例SARS患者体内抗体的产生情况和验证病毒Spike蛋白抗原的特异性。结果 95例SARS患者血清抗体结果中，大部分患者出现抗体阳性，抗SARS-CoVIgM总阳性率为91．6％（87／95），抗SARS-CoVIgG总阳性率为97．9％（93／95）；高暴露人群组和正常对照组的抗SARS-CoVIgM和抗SARS-CoVIgG阳性率为0％。经过携带Spike-protein基因的重组病毒Ad-sn感染COS-1细胞后表达的s蛋白抗原，使用SARS患者抗血清能够检测出特异性蛋白条带；重组病毒感染CNE-2细胞后，表达的S蛋白抗原，能够通过不同患者抗血清同时检测到相应的特异性抗原蛋白。结论 SARS患者感染SARS-CoV后，体内可产生相应抗体；利用SARS患者所产生特异性抗血清，可以检测出克隆SARS-CoV的Spike基因所表达的Spike蛋白。     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

原发性胆汁性肝硬化自身抗体谱的检测及临床应用

目的 探讨联合检测多种自身抗体在原发性胆汁性肝硬化(PBC)诊断中的价值及临床意义.方法 用免疫印迹法分别检测96例PBC患者,100例其他自身免疫性疾病(AID)患者和49名健康体检者血清中的抗线粒体(AMA)-M2亚型抗体、抗3E(BPO)抗体、抗Sp100抗体、抗旱幼粒细胞性白血病(PML)抗体、抗gp210抗体、抗肝肾微粒体-1(LKM-1)抗体、抗肝特异性胞质抗体-1(LC-1)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(SLA/LP).结果 96例PBC患者中AMA-M2、抗3E(BPO)抗体、抗Sp100抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体阳性率分别为76.0%、84.4%、32.3%、28.1%、35.4%,而以上5种自身抗体在其他自身免疫性疾病中的阳性率分别为13.0%、9.0%、3.0%、2.0%、1.0%;AMA-M2对PBC诊断的敏感度达76.0%,特异度达87.0%;抗3E(BPO)抗体对PBC诊断的敏感度达84.4%,特异度达91.0%;抗Sp100抗体对PBC诊断的敏感度达32.3%,特异度达97.0%;抗PML抗体对PBC诊断的敏感度达28.1%,特异度达98.%;抗gp210抗体对PBC诊断的敏感度达35.4%,特异度达99.0%,未检测到抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体及抗SLA/LP抗体;抗gp210抗体阳性患者肝功能衰竭的发生率明显高于抗体阴性患者(χ2 =11.17,P<0.01).结论 PBC患者中可检测到多种自身抗体,自身免疫性肝病自身抗体谱检测对PBC诊断、鉴别诊断、治疗及预后判断均有重要意义.     

HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性

目的 为开发和建立敏感、特异的抗HIV-1抗体的检测方法研制重组gp41抗原.方法 根据HIV-1的基因序列,设计并合成了1对PCR扩增引物,应用PCR技术从HIV-1 外膜基因组中扩增出HIV-1的gp41截短体,将扩增的基因片段插入质粒pET-28a中构建成重组表达质粒pET-gp41.诱导表达并纯化gp41重组抗原,对gp41进行了初步应用分析.结果 gp41在大肠埃希菌BL21 (DE3)中获得高表达,表达量占菌体总蛋白量的26.08%.纯化后截短体gp41的纯度为97.94%.经间接ELISA和免疫印迹检测,纯化后的表达产物gp41具有很高的抗原特异性和免疫反应性.结论 研制的重组抗原gp41有较强的抗原性和潜在的应用价值.     

M2抗体人源靶抗原三联体的克隆表达及其在原发性胆汁性肝硬化中的应用

目的 设计克隆表达抗原蛋白三联体BPO，利用纯化的重组BPO，建立原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)特异性免疫学诊断方法。方法 利用基因工程方法克隆表达M2抗原及其三联体BP0，并加以鉴定。纯化BPO，建立ELISA法。应用ELISA法检测17例PBC患血清M2抗体，以167例非PBC患和1225例健康人作对照。结果 17例临床诊断为PBC的患，M2抗体均为阳性，而对照组M2抗体均为阴性。结论 本法检测M2抗体有较好的敏感性及特异性，为PBC的临床诊断提供了有效手段。     

MIT3、抗gp210和抗sp100联检在原发性胆汁性肝硬化诊断中的价值

目的比较新型研发的PBC筛查试剂盒与单个MIT3,以及2个抗核抗体(ANA)gp210和sp100 ELISA检测试剂盒在中国人群中PBC诊断的性能。方法使用PBCscreen ELISA筛查试剂盒和单独针对MIT3、gp210和sp100抗原的ELISA试剂盒,对95例确诊PBC患者、125例非PBC患者(自身免疫性肝炎/原发性硬化性胆管炎18例,病毒性肝炎32例,其他肝脏疾病21例),以及健康人54例的血清样本进行检测。结果 PBC Screen ELISA法检测敏感性为76.8%,特异性为95.2%。特异性与结合单独ELISA法检测MIT3、gp210和sp100抗体的特异性96.0%相当。在32例用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,ⅡF)检测为阴性的PBC患者中,有15(46.9%)例PBC Screen ELISA检测结果为阳性。结论 PBC Screen ELISA是理想的一线PBC筛查试剂,尤其对于ⅡF筛查为阴性的PBC患者展现出优良的评估性能。     

重组泡球蚴主要表面抗原在棘球蚴病免疫诊断中的效果

目的 研究非融合表达重组抗原用于棘球蚴病免疫诊断的效果。方法 将泡球蚴主要表面抗原基因编码序列克隆于原核非融合表达载体pQE30（＋）并进行表达。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）及免疫印迹（WB）试验对重组抗原鉴定。亲和层析纯化重组抗原，用于酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清特异性抗体。结果 SDS—PAGE及WB分析显示泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌内得到了高效非融合表达。以此重组抗原进行ELISA试验，检测棘球蚴病68例，阳性率达97．1％，检测囊虫等其他感染性疾病80例及健康人血清20份，阴性符合率达98％。结论 泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌中获得了高效非融合表达，以该重组抗原建立的ELISA试验，对棘球蚴病诊断具有较高的敏感性和属特异性。     

原发性胆汁性肝硬化患者抗gp210抗体与核膜型抗核抗体的检测及其临床意义

目的探讨抗gp210抗体与核膜型抗核抗体对原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的诊断意义。方法选取PBC患者100例,60例自身免疫性肝炎(AIH)患者、50例慢性乙型肝炎(HBV)患者和50例慢性丙型肝炎(HCV)患者作为疾病对照组,50例献血员(BD)作为正常对照组。间接免疫荧光法检测自身抗体,免疫印记法检测抗gp210抗体。结果间接免疫荧光法检测结果 ,抗核抗体(ANA)阳性60例,抗线粒体抗体(AMA)阳性100例,抗平滑肌抗体(SMA)阳性3例。免疫印记法检测PBC患者抗gp210阳性33例(阳性率33%),AIH患者抗gp210阳性8例(阳性率13%),HBV、HCV、BD组均阴性。PBC患者gp210阳性组与阴性组ANA滴度比较,差异无统计学意义;gp210阳性组90.9%表现核膜型,其次表现核点型,而gp210阴性组19.4%表现核点型,其次为着丝点型及核膜型等。PBC患者抗gp210阳性患者与阴性患者ALT、AST、Tbil、GGT、ALPI、gGI、gAI、gM水平差异均无统计学意义(P0.05)。gp210阳性患者肝硬化发生率(28/33例,84.8%)明显高于阴性患者(33/67例,49.3%)(P0.01)。结论抗gp210抗体阳性同时ANA为核膜型有助于PBC患者的诊断,并且抗gp210抗体可以作为预后指标。     

血型A抗原的模拟多肽的表达及功能研究

目的融合表达血型A抗原的模拟多肽，初步鉴定融合蛋白结合抗A抗体的能力。方法PCR克隆扩增血型A抗原模拟多肽（P5）和谷胱苷肽S-转移酶（GST）编码基因，并连接成P5-GST。双酶切后克隆入原核表达质粒pET28b，经E．coil DH5a扩增后纯化并酶切、测序鉴定。以BL21（DE3）为表达菌，在IPTG诱导下表达P5-GST融合蛋白．Ni-NTA柱纯化蛋白。红细胞凝集抑制实验分析融合蛋白模拟血型A抗原的能力。ABO-EIJSA初步分析P5．GST融合蛋白检测血型抗体的效能。结果成功构建P5基因和GST基因融合的原核表达质粒pET28b-P5-GST，目的基因可以高效表达，纯化的融合蛋白具有良好的模拟血型A抗原的能力。基于P5-GST融合蛋白的ABO—ELISA具有一定的检测血浆抗A抗体的能力。结论血型A抗原的模拟多肽序列与GST的融合表达蛋白具有特异性结合抗A抗体的特性，本融合蛋白具有替代血型A多糖抗原潜能，为发展新型的抗A抗体检测方法提供依据。     

Sa抗原的提取及抗Sa抗体的检测

目的制备Ｓａ抗原，建立抗Ｓａ抗体的检测方法，测定自身免疫性结缔组织疾病中抗Ｓａ抗体的阳性率。方法从人胎盘中提取Ｓａ抗原，用阴离子交换法进一步纯化，采用免疫印迹法，检测抗Ｓａ抗体。结果抗Ｓａ抗体与类风湿因子、抗ＲＡ３３、抗Ｒｏ（ＳＳＡ）、抗Ｌａ（ＳＳｂ）、抗ＲＮＰ、抗Ｓｍ、抗Ｊｏ－１和抗Ｓｃｌ－７０抗体等自身抗体无交叉反应。抗Ｓａ抗体在各组患者中的阳性率分别为：类风湿性关节炎（ＲＡ）３１．９％（６１／１９１），干燥综合征３．０％（２／６７），系统性红斑狼疮４．３％（２／４６），而白塞病（６６例）、多发性肌炎／皮肌炎（６０例）、其他自身免疫性结缔组织病（６６例）与正常人（４０例）中均为０。抗Ｓａ抗体对ＲＡ的特异性为９８．６％。结论抗Ｓａ抗体是一种对ＲＡ诊断较为特异的新型自身抗体     

原发性胆汁性肝硬化血清学抗体与戊型肝炎病毒抗体间的相关性分析

目的回顾性研究127例原发性胆汁性肝硬化(PBC)相关血清学自身抗体与戊型肝炎病毒(HEV)抗体之间的相关性。方法与PBC相关自身抗体:抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2)、重组M2融合蛋白抗体(M2-3E/BPO)、抗核点型靶抗原蛋白100(抗-sp100)、抗核孔复合物210跨膜糖蛋白抗体(抗-gp210)、抗着丝粒蛋白B抗体(CENP B),以上抗体中单一或多抗体阳性血清127例与93例系统性红斑狼疮(SLE)患者、92例类风湿性关节炎(RA)患者和122例健康人血清样本同期分别采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HEV IgG/IgM抗体。结果 PBC相关自身抗体阳性组、健康人对照组、SLE和RA组的HEV-IgG抗体阳性率分别是55.9%、27.0%、23.7%、40.2%,经χ2检验PBC相关自身抗体阳性组与其他三组差异有统计学意义(P0.05)。PBC相关单一自身抗体阳性组和多抗体阳性组之间HEV-IgG抗体阳性率差异无统计学意义(χ2=0.319,P0.05)。性别差异无统计学意义(χ2=0.281,P0.05)。结论 PBC相关自身抗体阳性血清存在HEV抗体高阳性率。PBC相关自身抗体和HEV-IgG抗体的实验室检测可能存在相互干扰。     

数种检测抗核抗体、抗盐水可提取核抗原抗体方法的对比分析

目的：评价检测抗核抗体和抗盐水可提取核抗原（ENA）抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）的性能。方法：将相关纯化抗原包被的ELISA试剂和间接免疫荧光抗核抗体（IFANA）试验、免疫印迹法（IBT）和对流免疫电泳地（CIE）等用于20份系统性红斑狼疮（SLE）、10份干燥综合征（SS）患者以及30份健康对照血清中自身抗体的检测。结果：ELISA和IFANA抗核抗体筛选试验对结缔组织病诊断的敏感性和特异性差异无显著性（P＞0．05），但5例IFANA阴性ELISA阳性的患者血清经鉴定为抗SS－A和／或dsDNA抗体阳性；1例ELISA阳性则IFANA阴性的正常人血清经证实为ELISA试验假阳性，ELISA、CIE、IBT3种方法检测抗Sm抗体对诊断SLE的特异性均达到100％，敏感性差异无显著性（P值均＞0．05）。ELISA与IBT相比，在抗SS－A抗检检测上更为敏感（P＜0．01）。ELEISA与CIE法相比对抗SS－B抗体的检测也更敏感（P＜0．05）。结论：本研究中所用的ELISA抗核抗体检测试剂敏感性，特异性较好。     

原发性胆汁性肝硬化患者血清相关自身抗体检测及其临床意义

目的 探讨原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者血清自身抗体的临床意义。 方法 对248例不明原因的肝功能持续异常患者应用间接免疫荧光法（IIF）进行血清抗核抗体（ANA）、抗平滑肌抗体（SMA）检测,应用免疫斑点法（Euroassay）进行抗肝肾微粒体-1（LKM-1）、抗肝溶质抗原-1（LC～1）、抗可溶性肝抗原／抗肝胰抗原（SLA／LP）、抗线粒体M2型（AMA-M2）检测,并结合生化指标及免疫球蛋白指标进行分析。 结果 248例不明原因的肝功能持续异常患者中,PBC51例,占20．5％,其余197例原因不明。PBC患者的AMA-M2抗体均为阳性,ANA阳性32例占62．7％。ANA的主要荧光模式为核膜型和核点型。PBC患者ALP、GGT及免疫球蛋白M高于乙型肝炎肝硬化患者。在51例PBC中,4例表现为自身免疫性肝病重叠综合征,其中1例抗SLA／LP阳性,提示PBC与自身免疫性肝炎（AIH）3型重叠,1例抗LKM-1阳性,提示PBC与自身免疫性肝炎（AIH）2型重叠,2例ANA,SMA抗体阳性,提示PBC为与自身免疫性肝炎（AIH）1型重叠综合症。 结论 自身抗体及肝抗原抗体的检测对PBC诊断有重要意义;PBC患者存在PBC／AIH重叠综合征;对原因不明的肝功能异常的患者进行肝抗原自身抗体的检测有助于临床诊断。