iNOS基因重组逆转录病毒的包装及高滴度病毒液的制备

目的利用逆转录病毒载体PLXSN介导iNOS基因转染,为逆转录病毒介导的iNOS转基因防治血管移植术后再狭窄的研究奠定实验基础。方法采用QIAGEN plasmid Maxi Kit纯化PLXSN-iNOS;通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSN-iNOS导入包装细胞PA317中;经G418筛选获得抗性克隆,命名为PA317/iNOS;提取抗性克隆细胞基因组DNA,用PCR进行鉴定;用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度。结果PA317/iNOS细胞能稳定合成和分泌重组逆转录病毒颗粒,并在约142 bp处扩增出特异的片段;PLXSN-iNOS病毒上清的最高滴度为1.6×106CFU/mL。结论逆转录病毒载体PLXSN能有效介导iNOS基因的转染。     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建

目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA 317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.     

分泌高滴度重组人糖皮质激素β受体正义和反义cDNA逆转录病毒细胞系的建立

目的：建立分泌重组人糖皮质激素β受体cDNA的逆转录病毒的细胞系。方法：脂质体介导含人糖皮质激素β受体正义和反义全长cDNA的重组逆病毒质粒分别转染包装细胞PA317，经G418筛选抗性克隆。结果：细胞培养上清液的RT-PCR联合序列分析表明G418抗性PA317细胞克隆能稳定合成并分泌相应的重组病毒颗粒；NIH3T3细胞测定的正、反义cDNA重组病毒滴度分别为2×105 CFU/ml和1.8×105 CFU/ml。结论：成功建立了能分别产生重组hGRβ正义和反义cDNA逆转录病毒的高滴度细胞系，为后续研究工作打下坚实基础。     

HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.     

iNOS转基因在血管平滑肌细胞的表达

目的 研究逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）中的表达。方法 通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSNiNOS导入PA317细胞中；经G418筛选获得抗性克隆；用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度；将病毒上清转染体外培养的VSMC；采用RT-PCR、Western blot检测VSMC内iNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PLXSNiNOS转染体外培养的VSMC48h后，在VSMC内可检测到外源性iNOS mRNA和蛋白；而用PLXSN转染体外培养的VSMC48h后未能检测到外源性iNOS mRNA和蛋白表达。结论 逆转录病毒介导iN0s基因可高效转染体外培养的VSMC，并在细胞内表达iNOS蛋白。     

含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒

目的 通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩。方法 应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因。收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况。结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱。GP2-293细胞转染VSV-G基因后可产生(7.5±1.4)×105cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达。结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛。     

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体 ,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株 ,为利用去C 末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 :用限制性内切酶从质粒PcJak3(ΔC)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定 ;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G4 18筛选抗性细胞 ,转染的包装细胞包装出病毒粒子 ,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段 ;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G4 18筛选抗性克隆 ,检测出病毒滴度 ;经免疫沉淀 (IP)、SDS PAGE电泳、Westernblotting检测NIH3T3细胞中Jak3(ΔC)的表达情况。结果 :①重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC)酶切和DNA检序均表明已含有 2 796bp的Jak3(ΔC)基因 ;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段 ;③病毒滴度为 1.2～ 2 .0× 10 4CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(ΔC)蛋白 ,其分子量为 10 7KD。结论 :我们已成功构建了去C 末端Jak3重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆 ,为利用Jak3(ΔC)对白血病     

含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒

目的通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩.方法应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因.收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况.结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱.GP2-293细胞转染VSV-G 基因后可产生(7.5±1.4)×l05cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达.结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛.     

表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L 的双顺反子逆转录病毒基因转移体系     

14—3—3蛋白

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝／苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。七种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有着密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在MAPK级联放大效应等信号转导途径中发挥调控作用。     

微卡（VACCAE）联合2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核的临床效果

目的应用微卡(VACCAE)联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3治疗初治涂阳肺结核的临床疗效。方法选取100例初始涂阳肺结核患者,随机分为对照组50例和观察组50例,两组均采用"世界银行贷款+中国结核病控制项目"的2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗,观察组在上述常规化疗药基础上联用微卡22.50μg深部肌肉注射;观察两组的痰菌阴转率、病灶吸收率、空洞闭合率、临床症状改善情况、不良反应发生率。结果治疗1个月后,观察组临床症状完全消失率显著高于对照组(P<0.05)。观察组的痰菌转阴率、病灶吸收率、空洞闭合率均优于对照组(P<0.05)。微卡注射后无严重不良反应。结论微卡联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核能够快速缓解临床症状,且疗效显著不良反应小,具有临床应用价值。     

Hypoxia-induced MTA1 promotes MC3T3 osteoblast growth but suppresses MC3T3 osteoblast differentiation

Background

Bone fracture is one of the most common physical injuries in which gene expression and the microenvironment are reprogramed to facilitate the recovery process.

Methods

By specific siRNA transfection and MTT assay, we evaluated the effects of metastasis-associated gene 1 (MTA1) in osteoblast growth. To show the role of MTA1 in osteoblast under hypoxia conditions, by overexpressing and silencing MTA1 expression, we performed mineral deposition and alkaline phosphatase activity assay to observe the differentiation status of osteoblast cells. Real-time PCR and Western blot assays were adopted to detect the expression of certain target genes.

Results

Here, we reported that hypoxia-induced MTA1 expression through hypoxia-induced factor 1 alpha (HIF-1α) and stimulated the growth of osteoblast MC3T3 cells. Silencing of MTA1 through specific siRNA suppressed MC3T3 cell growth and elicited cell differentiation and induced alkaline phosphatase activation and the upregulation of bone morphogenetic protein-2 and osteocalcin.

Conclusions

We found that MTA1 was regulated by HIF-1α in hypoxia circumstance to suppress osteoblast differentiation. These findings provide new insights for bone fracture healing and new strategies to develop potential targets to promote fracture healing.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s40001-015-0084-x) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

新生儿脐血血清rT_3及T_3/rT_3值的测定

测定300例新生儿脐血血清T_4、T_3、rT_3及T_3/rT_3值。其平均值±标准差依次为98.65±27.6ug/L,0.49±0.19ug/L,3.06±0.25ug/L;T_3/rT_3值平均为0.16。脐血T_4、rT_3值高于正常成人,而T_3及T_3/rT_3值明显低于正常成人。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

  目的 探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法 共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。     

血小板生长因子在NIH3T3成纤维细胞和MT3转化细胞应答中的作用

血小板生长因子(PDGF)通过促进细胞外Ca~(2 )内流,增加细胞内Ca~(2 )浓度,但在亲代NIH3T3成纤维细胞和转化的MT3细胞中,却表现出不同的作用。在亲代NIH3T3成纤维细胞中,PDGF能够抑制舒缓激肤介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加,未能见到细胞内Ca~(2 )波动现象;而在转化的MT3细胞中,PDGF丧失了对舒缓激肽介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加的抑制作用,常常引起细胞内Ca~(2 )波动现象。对于DNA的合成,PDGF在两种细胞中,也表现出有时程的差异。     

SRSV/3T3和NIH/3T3细胞膜的分离和蛋白质组分的初步比较

应用甘油低渗两相分配法分离了SRSV/3T3细胞质膜(SM)和NIH/3T3细胞质膜(NM)。经Na~+、K~+-ATP酶和葡萄糖-6-磷酸酶等标志酶活性鉴定,表明SM和NM纯度较高。经SDS-PAGE分析比较,发现SM和NM的蛋白质组分有较明显差异。SM有7种独特的组分,分子量分别为2.29×10~(-22)、2.18×10~(-22)、9.79×10~(-23)、9.60×10~(-23)、8.63×10~(-23)、5.49×10~(-23)和4.78×10~(-23)kg。NM有两种特有的组分(1.15×10~(-22)和4.17×10~(-23)kg)。在彼此共有的蛋白质组分中,也有许多组分在含量和电泳迁移速度上存在着程度不同的区别。