腺病毒介导的靶向蛋白激酶B1和环氧合酶2短发夹RNA抑制人胃腺癌细胞的侵袭和转移

目的 构建靶向性蛋白激酶B1(Aktl)和环氧合酶2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对SGC-7901人胃腺癌细胞侵袭和转移的抑制效果.方法 构建腺病毒载体pGSadeno-Aktl+COX-2(rAd5-A+C)并体外转染SGC-7901人胃癌细胞株后,用实时定量PCR和蛋白印迹分别检测对照组SGC-7901、空载组rAd5-HK和治疗组rAd5-A+C中Aktl、COX-2 mRNA和蛋白质的表达,其中以对照组SGC-7901、空载组rAd5-HK作为阴性对照.用ELISA法分别检测它们的MMP-2和MMP-9含量;用Transwell法分析它们的侵袭和转移能力.结果 构建的rAd5-A+C重组腺病毒载体在转染SGC-7901细胞48 h后可显著抑制Aktl和COX-2 mRNA的表达,而治疗组rAd5-A+C的Aktl和COX-2蛋白表达量与对照组和空载组相比分别下调68.4%和60.2%(均P<0.01);rAd5-A+C组中MMP-2和MMP-9含量分别为(39.7±1.7)ng/ml(31.3±3.6)ng/ml,明显低于对照组SGC-7901(278.4±15.5)ng/ml(225.4±15.1)ng/ml和卒载组rAd5-HK(275.5±2.1)ng/ml、(226.0±23.3)ng/ml(P=0.01、P=0.021).结论 腺病毒介导的靶向性Aktl和COX-2shRNA可抑制人胃腺癌细胞的侵袭和转移.     

靶向性蛋白激酶B1和环氧合酶-2 shRNA腺病毒载体的构建和在人胃癌细胞的表达

目的 构建靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和环氧合酶-2(COX-2)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,观察其在人胃癌细胞株SGC-7901中的表达.方法 利用同源重组技术构建重组腺病毒载体pGSadeno-Akt1+COX-2(pGSadeno-A+C),经酶切及测序鉴定后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组rAd5-A+C腺病毒,并测定病毒的滴度.体外转染人胃癌细胞株SGC-7901后,Real-time PCR和蛋白印迹分别检测Akt1和COX-2 mRNA和蛋白质的表达.结果 成功构建rAd5-A+C重组腺病毒,测定包装的病毒滴度为1.0×1010pfu/ml.转染组Akt1和COX-2 mRNA表达明显下调,其△Ct值分别是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比rAd5-HK空载组(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和对照组(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高(P<0.01),而空载组和对照组比较ΔCt值无明显变化(P>0.05).同样转染组Akt1和COX-2蛋白表达量与空载组和对照组比较分别下调70.5%和63.7%(P<0.01),空载组和对照组比较Akt1和COX-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 靶向性Akt1和COX-2的shRNA腺病毒载体可以特异性抑制Akt1和COX-2的表达,可能成为胃癌靶向性Akt1和COX-2基因治疗的新策略.     

人肠凝集素-1真核表达载体的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的 构建人肠凝集素-1( ITLN-1)基因的真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增ITLN-1 cDNA,定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1,测序鉴定;在脂质体的介导下,重组质粒瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901 72 h后,Western blot法检测细胞培养上清中ITLN-1表达,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法、Transwell小室实验检测癌细胞增殖、侵袭活性.结果 真核表达载体pEGFP-ITLN-1转染SGC-7901细胞72 h后,ITLN-1 蛋白表达上调5.72倍(P＜0.01),细胞增殖活性降低52.8％ (P＜ 0.01),细胞侵袭能力下调58.1％ (P＜0.01).结论 成功构建人ITLN-1真核表达载体,转染胃癌细胞过表达后,能抑制癌细胞的增殖和侵袭活性.     

双链蛋白聚糖对胃癌细胞生长作用研究

目的:研究双链蛋白聚糖(biglycan,BGN)对人胃癌细胞系SGC-7901的细胞增殖、周期及凋亡等生长作用影响。方法:构建重组质粒pIRES2-EGFP/BGN,转染胃癌细胞株SGC-7901,获得胃癌稳转细胞株SGC-7901/BGN。通过细胞增殖实验(CCK-8法)、平板克隆实验、流式细胞技术,分别检察BGN过表达对SGC-7901细胞增殖、克隆形成、周期及凋亡的影响。结果:SGC-7901/BGN组胃癌细胞较SGC-7901/空载组生长明显抑制(P<0.01),细胞培养板形成的克隆数明显减少[(209.7±12.6)比(326.0±15.1)];同时过表达BGN可促进胃癌细胞的凋亡[(10.7±1.5)%比(5.3±1.1)%],且将细胞周期阻止在G1期[(55.7±2.1)%比(37.6±1.8)%]。结论:胃癌细胞过表达BGN可抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成。BGN可能通过将细胞周期阻滞在G1期、诱导细胞凋亡,从而发挥其生长抑制的生物学效应。     

组织因子基因siRNA对胃癌侵袭力的影响

目的：探讨应用RNA 干扰技术抑制胃癌细胞组织因子(TF) 基因表达对胃癌侵袭能力的影响。 方法：构建pSUPER /TF-siRNA重组载体, 并将其转染入胃癌细胞SGC-7901中;RT-PCR和Western blot检测转染前后TF的表达水平;应用Boyden小室检测对胃癌细胞的侵袭能力。 结果：双酶切鉴定重组载体构建成功。RT-PCR和Western blot检测显示pSUPER /TF-siRNA1重组载体明显抑制SGC-7901细胞TF基因的表达(P<0.05)。Boyden小室体外侵袭实验证实, 转染pSUPER/TF-siRNA1 质粒的SGC-7901穿膜细胞均数较其他无干扰组的细胞均数明显减少(P<0.05)。 结论：以TF 基因作为靶点应用RNA 干扰技术抑制其表达可降低胃癌细胞体外侵袭移能力, 故其有望成为胃癌治疗的一个新靶点。     

抑制HO-1基因表达对人胃癌细胞系SGC-7901的影响

目的：通过构建shRNA沉默HO-1基因,研究抑制HO-1基因表达对胃癌细胞系SGC-7901的影响。方法：构建靶向HO-1基因的shRNA干扰质粒转染人胃癌细胞系SGC-7901,荧光共聚焦显微镜下观察转染效率;应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、细胞免疫化学法分别在基因、蛋白质水平检测HO-1基因的抑制效果;应用MTT法检测HO-1基因沉默后胃癌细胞的生长情况。结果：与对照组比较,shRNA在基因、蛋白质水平特异地抑制了胃癌细胞SGC-7901中HO-1的表达,抑制率分别为62.4%、67.6%;HO-1的表达被抑制后,胃癌细胞SGC-7901生长受抑制（P〈0.05）。结论：shRNA-HO-1可有效抑制胃癌细胞中HO-1的表达;HO-1的沉默表达可抑制肿瘤细胞生长。     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

RhoC-siRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响

目的构建RhoC-siRNA表达载体，研究其对肝癌细胞体外侵袭潜能的影响。方法以脂质体转染法稳定转染人SK-Hepl肝癌细胞株，Western印迹鉴定转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况，观察转染前后细胞黏附、运动及体外侵袭能力的改变。结果酶切及测序证实RhoC—siRNA真核表达载体构建成功。通过Western印迹检测证实，转染RhoC—siRNA表达载体的肝癌细胞中RhoC蛋白表达抑制达60％，其黏附、移动及体外侵袭能力均降低。结论RhoC—siRNA表达载体能有效抑制RhoC在肝癌细胞株SK—Hepl中的表达，同时抑制细胞的侵袭转移潜能，为肝癌的生物学治疗提供新的方法。     

arresten对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的抑制作用的研究

目的探讨arresten抑制人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的作用。方法构建包含arrestenc DNA的分泌型真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-ss-arresten,并以脂质体法将重组质粒转染至SGC-7901细胞。蛋白印迹法（Western blot）检测SGC-7901是否分泌表达arresten,同时,通过生长曲线绘制及生长周期测定的方法了解上述转基因措施本身对SGC-7901细胞的体外生物学特性的影响。将转基因的SGC-7901细胞株接种至裸鼠皮下,使其在接种局部表达arresten,观察肿瘤生长情况。结果成功构建了分泌型真核表达载体pcDNA3．1（＋）-ss-arresten,并获得了可分泌表达arresten的人胃癌SGC-7901细胞株。质粒转染对SGC-7901细胞增殖特性无影响。转基因SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤生长缓慢。结论arresten抑制人胃癌SGC-7901移植瘤的生长,其途径可能是通过抑制其滋养血管的生长而实现。     

基因特异性短发卡RNA抑制缺氧再给氧人脐静脉内皮细胞的转化生长因子-β1过表达

目的 构建针对人转化生长因子(TGF)-β1基因的短发卡RNA(shRNA)表达载体并检测其对缺氧再给氧(A/R)损伤后的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株的TGF-β1基因表达的影响.方法 设计、合成并构建针对TGF-β1 mRNA的shRNA表达载体,选择效果好者转染HUVEC株,再进行A/R试验,用免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF.β1蛋白质和mRNA的表达.结果 优选出的表达载体pT12抑制率达(46.4±3.7)%.接受了MR的T、H、L及C组,TGF-Bβ1蛋白的A值分别为0.252±0.032、0.385±0.037、0.406±0.057及0.419±0.041,高于N组(0.103±0.008,P<0.01),转染r pT12的T组A值又显著低于H、L和C组(P<0.01).A/R试验后T、H、L及c组的TGF-β1 mRNA转录量也多于N组(P<0.05),T组的TGF-β1 mRNA转录量低于作为对照组的H组、L及C组(P<0.05).结论 TGF-β1基凶特异性shRNA表达载体能有效地抑制A/R损伤导致的HUVEC株TGF-β1基因过度表达.     

靶向沉默SPHK1基因诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨用小干扰核酸（SmallinterferingRNA,siRNA）靶向沉默神经鞘氨酸激酶1（sDhingosinekinasel,SPHKl）基因敲除后对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法人工化学合成SPHKlsiRNA和对照siRNA,分别转染胃癌SGC-7901细胞。Westernblot法检测SPHKl、Bcl-2和Bax蛋白的表达;流式细胞术（FlowCytometry,FCM）检测细胞凋亡的变化。结果SPHKlsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,SPHKl蛋白表达明显下调;与对照组相比,SPHKlsiRNA转染组Bcl一2蛋白表达下调了55％（P〈0．01）,Bax蛋白表达差异无统计学意义,Bcl-2／Bax比值下调54％（P〈0．05）;SPHKlsiRNA转染组早期凋亡细胞明显增多（P〈0．01）,晚期凋亡细胞无明显变化。结论SPHKl特异性siRNA可阻断SGC-7901细胞SPHKl蛋白的表达,并通过影响Bcl-2通路诱导细胞凋亡。     

榄香烯对胃癌细胞p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的 探讨榄香烯对人胃癌SGC-7901细胞株增殖的影响,以及与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的关系.方法 用不同浓度的榄香烯处理胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测细胞增殖情况;光镜和透射电镜观察形态学改变;Western blot方法检测P38和磷酸化P38(P-P38)的表达.结果 榄香烯抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,并呈浓度和时间依赖性;在光镜和透射电镜下可以观察到典型的细胞凋亡形态学改变;经0.08 mg/ml榄香烯作用4 h后,胃癌SGC-7901细胞中p38MAPK通路被激活,p-P38表达与对照组相比升高3.72倍,差异有统计学意义(P＜0.01),而P38总蛋白量未发生明显变化.预先应用p38MAPK通路抑制剂SB203580作用24 h与单用榄香烯作用组比较,p-P38表达下降54.12%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 榄香烯可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖,诱发细胞凋亡,其机制可能与p38MAPK通路有关.     

细胞因子诱导杀伤细胞杀伤胃癌的特异性与非特异性研究

目的 观察特异性与非特异性杀伤在细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外杀伤胃癌细胞(SGC-7901)中所起的作用.方法 从正常人外周血单个核细胞诱导树突状细胞(DC)、CIK细胞,用人胃癌细胞SGC-7901提取肿瘤抗原致敏DC,用DC诱导CIK生成DC诱导CIK细胞(DC-CIK)和经胃癌抗原致敏的DC诱导CIK细胞(抗原-DC-CIK).培养的第14天,用流式细胞仪检测CIK、DC-CIK、抗原-DC-CIK细胞表型CD3、CD3/CD8和CD3/CD56.以CIK、DC-CIK和抗原-DC-CIK为效应细胞,以经主要组织相容性复合体(MHC)分子阻断的SGC-7901细胞和未经MHC分子阻断的SGC-7901细胞为靶细胞,效靶比分别为5:1、10:1、20:1,用噻唑蓝(MTT)比色法分别检测各组杀伤效应(每组n=3).结果 (1)培养的第14天,抗原-DC-CIK中CD3~+CD56~+和CD3~+CD8~+双阳性细胞的比例较DC-CIK和单独培养CIK明显增高(P均<0.01).(2)效靶比为20:1时,CIK组、DC-CIK组、抗原-DC-CIK组对SGC-7901的杀伤活性分别为:(46.6±2.2)%、(52.6±1.6)%、(72.5±2.1)%(P均<0.01);对经MHC分子阻断的SGC-7901的杀伤活性分别为:(44.3±1.1)%、(49.9±0.9)%、(50.4±1.9)%.抗原-DC-CIK中特异性杀伤占总杀伤效力的比例明显高于DC-CIK和CIK.结论 CIK杀伤胃癌细胞以非特异性杀伤为主,特异性杀伤仅占总杀伤效力的4.9%;未致敏的DC诱导CIK后,总杀伤效力增强,以非特异性杀伤为主,特异性杀伤效力增加不明显,占总杀伤效力的5.1%;抗原致敏的DC诱导CIK后,杀伤仍以非特异性杀伤为主,特异性杀伤效力大幅度增加,占总杀伤效力的30.5%.     

Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究

目的：观察Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法：采用脂质体lipofec-tamine2000介导的方法,将Smac基因转入胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western-blot法检测未转染对照组、空载体pcDNA3．1转染对照组、pcDNA3．1-Smac转染组胃癌细胞中Smac基因的表达。选用紫杉醇（1、5、10ug／mL）处理转染前后的胃癌细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性,倒置显微镜下观察细胞形态变化并摄片。结果：同未转染对照组和空载体pcDNA31转染对照组比较,pcDNA31-Smac转染组SGC-7901细胞SmacmRNA和蛋白表达水平显著增高（F）〈O01）;紫杉醣处理24、48h后,pcDNA3．1-Smac转染组细胞生长抑制率增加（P〈O01）;使用化疗药物后,细胞明显变圆、折光增强、漂浮细胞增多,pcDNA3．1-Smac转染组细胞形态变化最为显著。结论：转染外源性Smac基因并使其在胃癌细胞中过表达,能提高SGC-7901细胞对化疗药物的敏感性。     

蛋白激酶B siRNA 转染对胃癌SGC-7901细胞生长增殖的影响

目的:探讨蛋白激酶B（PKB）基因沉默对人胃癌SGC-7901细胞增殖的作用。 方法:应用基因转染技术将蛋白激酶B家族的Akt2 siRNA转染至胃癌细胞中，采用Western blot、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术MTT等方法观察和检测Akt2 siRNA转染后对转染组细胞生长和增殖的影响。结果:与对照组比较，转染Akt2 siRNA组的胃癌SGC-7901细胞生长、增殖速度明显减缓（P＜0.01）， Akt2 siRNA组较对照组细胞的Akt2蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）;转染组出现梯状凋亡条带;细胞周期显示转染组细胞聚集在G2/M期。 结论:应用RNAi使蛋白激酶B基因沉默能使人胃癌SGC－7901细胞的生长受到抑制，胃癌细胞增殖速度减缓，其作用机理可能通过诱导细胞凋亡和抑制PI3/K信号传导通路而实现。Akt2有望成为胃癌基因治疗的新靶点。