SELEX技术筛选HCV非结构蛋白NS3的DNA适配子

目的 用配基指数富集的系统进化技术(SELEX)技术筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的DNA适配子.方法 构建随机ssDNA文库,两端为固定序列,中间为39 nt的随机序列,总长度为85 nt,将NS3蛋白包被在96孔板上,ssDNA与NS3蛋白进行亲和反应,洗去未结合的ssDNA,洗脱回收与NS3蛋白结合的DNA,PCR扩增后,磁珠法分离成单链.重复以上筛选步骤,直至筛选出高特异性和亲和力的核酸适配子.将核酸适配子连接质粒载体克隆转人大肠杆菌,挑选阳性克隆提取质粒外送到公司进行测序.结果 通过8轮筛选,成功筛选出DNA适配子,并获得其中6条克隆的DNA一级序列.6条适配子序列长度相同,均为85 nt,两端固定序列与设计相符,中间为随机序列,随机序列无共同保守系列.所有寡核苷酸适配子的二级结构以茎环和凸环为主.结论 以NS3蛋白作为药物研究的靶点,结合SELEX筛选技术研究其核酸适配子,具有巨大的潜力和研究价值.     

鼻咽癌核酸适配子的筛选及鉴定

目的利用指数富集的配套系统进化技术(SELEX)筛选人类疱疹病毒(EB病毒)阳性鼻咽癌细胞核酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库,通过SELEX技术,以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选,以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行10轮的筛选,克隆、测序,并对适配子进行鉴定。结果流式细胞仪检测亚文库与靶细胞的结合能力随着筛选轮数的增加荧光强度增强。聚类分析显示,适配子可以分为3个家族,1、2家族具有保守序列。结论初步建立EB病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库,筛选到具有亲和力和特异性的核酸适配子。     

SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子方法的建立

目的 建立SELEX筛选LPS的适配子方法,为后续大规模筛选奠定基础.方法 在成功构建含40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库的基础上,优化了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件;同时对液相筛选与固液相筛选两种方法进行比较,确定最优的筛选方法并进行4轮筛选.结果 确定了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应的最佳条件,采用液相筛选方法经过4轮筛选,随机单链DNA(ssDNA)文库与内毒素(LPS)的结合率明显上升,CPM值与初始库相比差异有统计学意义.结论 建立了SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子的筛选方法.     

SELEX技术筛选特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子

目的:筛选获得一种高亲和力的能特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子.方法:体外合成全长88 nt的单链DNA文库,通过反复的SELEX筛选获得特异性结合Anip973细胞的单链DNA适配子,并通过生物素-辣根过氧化物酶-链霉亲和素系统初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,将结合力最高的适配子库进一步...     

癌胚抗原特异性寡核苷酸适配子的体外筛选及其意义

目的:通过体外筛选获得癌胚抗原(CEA)特异性适配子,为高表达CEA肿瘤的靶向奠定基础。方法:构建长度为81 bp的随机ssDNA文库,体外筛选、富集CEA特异性适配子,通过配体介导的靶蛋白纯化实验检测经筛选的适配子与纯化蛋白结合;提取LS174T细胞总蛋白,免疫共沉淀检测经筛选的适配子与细胞总蛋白的结合。结果:经体外7轮筛选富集及筛选条件的优化,配体介导的靶标分离实验证实了筛选出的适配子与纯化CEA蛋白的结合;免疫沉淀及Westem blot证实了其识别并特异性结合天然状态的CEA。结论:经过体外7轮筛选,证实了所获得的CEA适配子可特异性地与纯化CEA和天然状态的CEA蛋白结合,为后续高表达的CEA肿瘤的靶向诊断和治疗奠定了初步的实验基础。     

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体

目的 通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术.方法 以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体.结果 通过6轮筛选,筛选得到的次级ssDNA库通过PCR扩增得到dsDNA,dsDNA与pMDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体.获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合.结论 利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力.     

重组 PBP2a 转肽酶区蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

目的：筛选和鉴定重组青霉素结合蛋白2a（PBP2a）转肽酶区蛋白的核酸适配体。方法利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,以重组 PBP2a 转肽酶区蛋白为靶标,从单链 DNA 文库中筛选能与之特异性结合的核酸适配体。筛选产物克隆测序后,对其进行结构分析和特性鉴定。结果经过11轮筛选,单链 DNA 文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第8、10轮筛选产物克隆测序,对获得的40个适配体进行分析,一级结构分析显示40个适配体并无共同的保守序列,二级结构预测分析表明,其可分为3个家族。其中13号适配体与重组 PBP2a 蛋白亲和力最高,并能与之特异性结合。结论利用 SELEX 技术成功筛选出特异性结合重组 PBP2a 转肽酶区蛋白的核酸适配体,为探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊疗新途径奠定基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞特异性核酸适配子的筛选和鉴定

目的 利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子,并对核酸适配子与大鼠BMSCs的结合方式及能力进行鉴定.方法 利用SELEX技术,以分离获取的大鼠BMSCs为靶点,从构建的核酸文库中最大程度富集与BMSCs特异性结合的核酸序列,流式细胞术检测文库富集的特...     

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

胃癌血清适配体的筛选及其鉴定

目的:以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用RT-PCR和靶标替换消减SELEX技术从胃癌血清中筛选得到高特异性?强亲和力的适配体?方法:以离心超滤(50 000超滤管)法处理后的胃癌血清作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,先将寡核苷酸文库与反筛磁珠(结合正常血清)结合,取上清再与筛选磁珠(结合胃癌血清)结合,洗去未结合的寡核苷酸分子,对结合在磁珠上的寡核苷酸分子进行分离和扩增,λ酶切法制备ssDNA次级库,进行10轮筛选,将第10轮的文库扩增得到dsDNA,利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段的dsDNA,并与pMDTM18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,测序获得适配体序列,同时用流式细胞术测定胃癌血清适配体的Kd值?结果:经过10轮筛选后,得到20条与胃癌血清结合的适配体?结论:特异性检测表明,筛选得到的胃癌血清适配体与胃癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中5?7?16?17?18号适配体能高特异性?强亲和力结合胃癌血清,与正常人血清不结合?该研究为胃癌的早期诊断提供了实验基础?     

针对U87-EGFRvⅢ细胞的适配子对胶质瘤荷瘤鼠的抑瘤作用

目的观察应用细胞一配体指数富集的系统进化技术（cellsystematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,CelbSELEX）筛选出的针对稳定过表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermalgrowthfactorreceptorvari—antⅢ,EGFRvⅢ）的U87-EGFRvⅢ细胞的适配子在荷瘤裸鼠动物模型中的抑瘤作用。方法选用4～6周的雄性裸鼠28只随机分为4组,分别为空白对照组、转染试剂对照组、DNA原库GN对照组、适配子U2治疗组,每组7只。皮下种植U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液建立荷瘤裸鼠动物模型,通过invivojet_PEI^TM转染试剂的作用将筛选得到的适配子U2和原库GN分别进行瘤内注射。给药结束1周后,对肿瘤的重量和体积大小进行统计学分析。结果在形体上U2治疗组肿瘤大小明显小于其他组,试剂组与原库GN组均没有明显的差异,统计学分析U2治疗组与其它组的肿瘤重量和体积均有差异（P〈0．05）。结论筛选得到的适配子对通过皮下种植U87一EGFRvUI细胞悬浮液建立荷瘤裸鼠动物模型中的肿瘤生长有一定的抑制作用,为适配子在荷瘤裸鼠动物模型中的应用提供了一定的技术理论基础。     

急性髓系白血病细胞单链DNA适体的体外筛选

目的:筛选识别急性髓系白血病M2型(acute myeloblastic leukemia M2 subtype,AML-M2)CD33+/CD34-细胞的核酸适体(aptamers)。方法:以AML-M2型白血病CD33+/CD34-细胞为靶细胞,正常人CD33+/CD34-细胞为反筛选细胞,采用细胞-指数富集配体系统进化(cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment,C-SELEX)技术,体外反复筛选单链DNA(single strand deoxyribonucleic acid,ssDNA)文库的适体,经聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)扩增产生次级文库。然后将最终轮次的次级ssDNA文库克隆、测序并分析各适体的一级和二级结构。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示:每轮筛选出来的次级ssDNA文库PCR扩增产物均可见到清晰的DNA条带。经过13轮的反复筛选,次级ssDNA文库与细胞结合的荧光强度从2.14%上升到51.12%,至第13轮趋于稳定状态。对30个克隆子序列测定结果显示:22个适体一级结构分别含有AAGTA,TATCT,AGATG和AAATT 4个保守序列,另8个适体无此保守序列。二级结构模拟结果显示:30个适体含有4种不同的茎环、凸环模拟结构。结论:C-SELEX技术可用于急性髓系白血病原代细胞适体的筛选,筛选到的AML-M2型白血病CD33+/CD34-细胞适体有望用于白血病的诊断与治疗。     

人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析

目的:筛选人重组S100A8蛋白特异性的适配体。方法:采用配体指数级富集系统进化(systematic evolu-tion of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以人重组S100A8蛋白为靶蛋白,以微孔板为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其适配体。利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并进行生物信息学分析。结果:经过11轮筛选,单链DNA文库与人重组S100A8蛋白的亲和力趋向稳定,将第11轮筛选产物克隆测序,对获得的30个适配体进行分析。一级结构分析显示30个适配体并无共同的保守序列,但有3对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是适配体与人重组S100A8蛋白特异性结合的基础。根据茎环和口袋的相对比例可将30个适配体分为4组,其中第1组中35号适配体与人重组S100A8蛋白亲和力最高。结论:获得了与人重组S100A8蛋白特异性结合的适配体群,为后续适配体的应用研究以及S100A8蛋白功能的研究奠定了基础。     

慢性髓细胞性白血病K562细胞适体的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定出慢性髓细胞性白血病（CML）K562细胞的寡核苷酸适体.方法：体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,采用生物素-链霉亲和素磁珠法制备次级文库,以正常人血液中提取的中性粒细胞为反筛细胞,利用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术筛选出与CMLK562细胞特异结合的适体.将筛选得到的适体回收纯化后连接pGEM-T质粒载体,经蓝白筛选后,随机挑选24个克隆子进行序列测定.采用荧光标记引物法检测ssDNA文库与K562细胞的亲和力,并用Clustal 2.05和DNA sis V2.5软件对适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测.结果：经过13轮循环筛选,CML K562细胞适体的A值从0.12上升到1.25,至第13轮A值无明显增高.一级结构分析无同源序列,但可分为6个家族,其中5个家族各自具有保守序列,家族6无保守序列.二级结构分析表明,适体形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础.结论：利用SELEX技术成功筛选出高亲和性的CML K562细胞适体.     

Cell-SELEX技术在肿瘤诊治中的应用进展

 Aptamers,selected by an in vitro process known as systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX),are single stranded DNA or RNA oligonucleotides with high selectivity,affinity and stability.Aptamers that can bind whole cells,especially cancer cells,are generated by a method called cell SELEX.Compared with antibodies,aptamers possess many advantages,including wide range of targets,quick and reproducible synthesis,nontoxicity and lack of immunogenicity,easy and controllable modification to fulfill the recognition of cancer cells.Aptamers conjugated nanomaterials gain more flexibility as cancer cell targeting tools.In this review,we discuss the application of cell-SELEX based aptamers in novel cancer biomarkers identification,cancer imaging,cancer therapy and enhanced targeting when conjugated with nanomaterials.     

肝癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及活性鉴定

目的:肝癌血清中含有已知和未知的标志物,可以作为SELEX筛选的靶标,获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配体,为肝癌早期诊断提供新的分子生物学检测方法。方法：收集50例经诊断证实为原发性肝癌患者的血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18-T载体连接进行转化、挑选单克隆团送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果：经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。结论：特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肝癌的早期诊断提供了新方法。