恶性疟原虫青蒿素抗疟药抗性研究进展

疟疾是由疟原虫感染引起的一种传染病,是全球最重要的公共卫生问题之一。世界卫生组织（WHO）推荐以青蒿素为基础的联合疗法（artemisinin-based combination therapies, ACTs）作为疟疾流行地区的非复杂性恶性疟的一线治疗。青蒿素及其衍生物的应用在降低全球疟疾发病率方面发挥了不可或缺的作用。但近年来,青蒿素类药物抗性的出现与扩散使全球疟疾的控制与消除面临巨大挑战。目前,与青蒿素抗药性关系最为密切的是恶性疟原虫第13号染色体上K13基因的突变,但近些年不断有研究表明K13并不能解释所有的青蒿素抗性。本文综述近年来恶性疟原虫对青蒿素产生抗性研究领域的相关研究进展,包括青蒿素抗药性的定义、检测方法、抗性相关的分子标记等。此外,本文所讨论的某些问题仍存在争议,还需深入研究。     

恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备

目的 通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8（PfAtg8）基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8（PfAtg8）的多克隆抗体,并验证其效价。 方法 体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行效价验证。 结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论 成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。     

恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的研究进展

恶性疟原虫产生氯喹抗性是疟疾防治中遇到的主要难题之一。存在于恶性疟原虫5号染色体上的多药抗药性基因1 (pfmdr1)和7号染色体上的cg2基因和pfcrt基因被认为是氯喹抗性相关基因。本文就其研究进展作一综述。     

恶性疟原虫类巨噬细胞迁移抑制因子基因的克隆和表达

目的克隆、表达恶性疟原虫的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)同源基因PfMif.方法参照人MIF基因(Humif)氨基酸序列在P.falcip arum基因组中找到同源核苷酸序列,设计特异引物,采用RT-PCR方法从恶性疟原虫3D7株红内期RNA扩增获得Pfmif基因;利用生物信息学软件分析所扩增的基因;原核表达重组PfMIF蛋白,并亲和纯化.结果从恶性疟原虫RNA中扩增到Pfmif基因,长度为351 bp,编码116个氨基酸,具有MIF家族蛋白的典型特征.成功的表达及纯化了融合有GST标签的重组PfMIF蛋白.结论获得来自恶性疟原虫的MIF同源基因,初步确定PfMIF是MIF家族的一个新成员.     

人工合成人恶性疟原虫58肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

使用DNA合成仪合成的人恶性疟原虫58肽抗原基因,与大肠杆菌表达性载体质粒PWR450—Ⅰ重组,转化到大肠杆菌JM83中。用斑点杂交技术和电泳分析DNA方法筛选出阳性重组转化菌株,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分析,证明合成基因在大肠杆菌中表达,产生与β—半乳糖苷酶融合的多肽。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

【目的】构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒 ,并检测在大肠杆菌BL2 1/DE3中的表达情况。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因 (Pf332 )片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定。用DNAstar软件对FCC1/HN株与 3D7株Pf332的P332 R1、P332 R2片段进行同源性比较。由IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达重组蛋白。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,大小分别为 489、42 9和 393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pGEX P332 R0、pGEX P332 R1、pGEX P332 R2重组质粒。序列分析结果显示 ,与 3D7株相比 ,FCC1/HN株P332 R1、P332 R2片段编码多肽分别缺少 2、4个相应的重复单元。在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达出 3个重组蛋白 ,相对分子质量分别为 46、44和 42。【结论】扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并在大肠杆菌BL2 1/DE3中成功表达。FCC1/HN株与 3D7株的P332 R1、P332 R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

[目的]构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒，并检测在大肠杆菌BL21/DE3中的表达情况。[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNAS中扩增Pf332基因（Pf332)片段，P332-R0、P332-R2，并分别插入pGEX4T-1原核表达载体，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定，用DNAstar软件对FCC1/HN株与3D7株Pf332和P332-R1、P332-R2片段进行同源性比较，由IPTG诱导在大肠杆菌BL21/DE3中表达重组蛋白。[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，大小分别为489，429和393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的pGEX-P332-R0,pGEX-P332-R1,pGEX-P332-R2重组质粒，序列分析结果显示，与3D7株相比，FCC1/HN株P332-R1、P332-R2片段编码多肽分别缺少2、4个相应的重复单元，在大肠杆菌BL21/DE3中表达出3个重组蛋白，相对分子质量分别为46、44和42。[结论]扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，并在大肠杆菌BL21/DE3中成功表达，FCCl/HN株与3D7株的P332-R1、P332-R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2的原核表达及多抗制备

目的克隆表达恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基,制备多抗,为该蛋白的功能研究奠定基础。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pGEX-KG中,构建PfRPA2/pGEX-KG原核表达载体,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,谷胱甘肽柱纯化蛋白,Westernblot检测其抗原性,以纯化的GST-PfRPA2免疫小鼠,制备抗PfRPA2的多抗,间接ELISA法检测鼠血清效价,Westernblot鉴定多抗特异性。结果成功构建了重组PfRPA2/pGEX-KG原核表达质粒,并在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,纯化表达产物,制备抗PfRPA2的鼠多抗,效价为10-7,Westernblot证实此抗体可识别恶性疟原虫内与PfRPA2蛋白位置对应的特异性条带。结论恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化表达产物能诱导小鼠生产能识别天然蛋白的特异性抗体。     

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因 Pfmdr1多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫：Pfmdrl基因中的关键性点突变是否与海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性有关。方法采用套式PCR法分别扩增Pfmdrl基因中含有第86位和1246位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,Pfmdrl基因第86位氨基酸均未发生点突变,即86位密码子是Asn而非突变型的Tyr;Pfmdrl基因发生D1246Y突变的样本有3个,其中1个是抗性株,2个为敏感株。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与Pfmdrl基因的多态性无显著关系。     

恶性疟原虫带7蛋白家族蛋白Cdna的克隆及表达产物特征分析

目的 分离、克隆恶性疟原虫带7蛋白家族蛋白编码基因pfstom,并对其功能进行初步研究。方法 根据国际恶性疟研究公共数据库释放的已完成序列数据(CoDing Sequence,CDS数据)设计引物,用RT—PCR方法从恶性疟原虫中国海南株(FCCl／HN)中得到其带7蛋白家族蛋白基因cDNA-pfstom。应用多种软件对其结构功能、基因进化特征以及同源性分析。用PET30a系统表达其具有stomatin样蛋白结构域的C端蛋白,免疫新西兰大白兔并纯化抗体。Western杂交检测其在FCCl／HN表达情况。结果 pfstom基因编码区全长1125bP,编码374个氨基酸,C端具有和人红细胞整合膜蛋白带7蛋白家族中stomatin样蛋白类似的结构。进化特征分析显示：在带7蛋白家族中,Pfstom蛋白与stomatin样蛋白亲缘关系较近。Western杂交发现Pfstom蛋白在FCCl／HN的滋养体期呈期特异性表达,在与膜相关和与膜不相关的感染红细胞蛋白提取物中都存在。结论 Pfstom是带7蛋白家族蛋白,在FCCl／HN红内期的滋养体期呈特异性表达,环状体期不表达,该蛋白是膜相关蛋白。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

恶性疟原虫PfRh5F2片段pTGub21b表达载体的构建及融合蛋白表达鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F2片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pTGub21b中,构建PfRh5F2/pTGub21b原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F2/pTGub21b原核表达系统,并在大肠杆菌中可溶性高效表达,表达产物能被恶性疟患者血清识别,而重组抗原免疫鼠血清也能识别恶性疟患者血样中的相应抗原。结论恶性疟原虫PfRh5 F2片段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

恶性疟原虫新的PDZ包含蛋白编码区基因的分离与克隆

目的：分离、克隆一种新的恶性疟原虫PDZ结构域包含蛋白（PfPCP）编码区基因,并初步研究其红内期表达。方法：分析恶性疟原虫基因组3号染色体数据库,设计特异的引物,利用RT－PCR从恶性疟原虫海南株红内期mRNA扩增PfPCP编码区基因;利用生物信息学相关软件分析所扩增的基因;利用Western印迹法分析PfPCP在红内期的表达。结果：从恶性疟原虫mRNA扩增到的PfPCP编码区基因长度为2076bp cDNA克隆,编码蛋白长为691氨基酸,具有典型的PDZ结构域。Western印迹显示,该基因在红内期裂殖体期特异性表达。结论：获得新的恶性疟原虫PfPCP编码区基因,该基因在恶性疟原虫红内期裂殖体期特异性表达。     

恶性疟原虫海南株节结相关组氨酸富集蛋白基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）节结相关组氨酸富集蛋白（KAHRP）基因，并进行序列分析。方法 采用PCR技术分两段从FCC1／HN株基因组A趸扩增出部分序列重叠的KAHRP基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这2个片段的序列，从而得到全长KAHRP基因序列。应用AnthProt、DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 恶性疟原虫FC1/HN KAHRP全基因长2358个核苷酸，在112至564位核苷酸是内含子，全基因编码634个氨基酸残基，其中赖氨酸含量为14．35％，丙氨酸含量为9．15％，组氨酸含量为7．72％；分子量为69．37kDa。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、FCR3、India-1、India-2、NF17、Palo-alto,PUPSP株KAHRP基因编码的氨基酸残残留基有52个氨基酸残基替代位点，并存在氨基酸残基序列的增加和缺失。经多参数综合分析，可能有5个潜在的抗原表位区。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株KAHRP基因。序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株KAHRP基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫核糖体小亚基rRNA部分基因片段的克隆及序列分析

目的了解我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA的核苷酸序列。方法根据已知恶性疟原虫核糖体小亚基rDNA序列．在其基因的中下游分别设计引物,采用聚合酶链式反应（PCR）技术,从云南省来源的恶性疟体外培养原虫的基因组DNA中扩增出的基因片段酶切后将其插入pUC118／119载体,用Biosystems373ADNA序列分析仪测定。结果我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA核苷酸序列,与巴西IMTM22／7G8株的序列比较,在该基困的第1563位有一个A被T替换。结论该突变点位于真核生物核糖作小亚基rRNA基因已知序列种类的第三个可变区域内。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的克隆与表达

目的 构建EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的原核表达载体。方法采用PCR的方法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出EBA-175Ⅱ区F2结构域856～1848bp基因,定向克隆入PMD18-T质粒,再经BamHI和XhoI酶切亚克隆人高效表达载体pET23a( )。重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在BL21(DE3)菌株中进行IPTG诱导表达。结果重组质粒经序列测定证实插入基因为目的基因,符合表达框架,经IPTG诱导,在BL21(DE3)菌株中以非融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示在约36．4kDa处可见明显蛋白增粗条带,与预期结果一致。结论成功构建了重组EBA～175Ⅱ区F2结构域基因表达载体,并在BL21(DE3)中有效表达。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。