沉默Etheràgo-go1基因调控VEGF／PI3K／AKT抑制骨肉瘤增殖和血管生成的研究

目的：检测沉默 Ether àgo-go 1（Eag1）基因对骨肉瘤增殖和血管生成的影响及其可能的调控机制。方法：构建抑制 Eag1表达的短发卡 RNA （short hair RNA,shRNA）重组腺病毒载体 Ad5-Eag1-shRNA 并感染骨肉瘤细胞株。采用实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR）和蛋白印迹技术（Western blot analysis,WB）检测 Ad5-Eag1-shRNA 的感染效能。采用 CCK-8法和裸鼠成瘤实验检测感染前后骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤体积的变化。采用免疫组化技术和 WB 技术分别检测感染前后裸鼠肿瘤组织中微血管密度（microvessel density,MVD）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的变化。采用 WB 技术检测感染前后骨肉瘤细胞中 VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）和蛋白激酶 B （protein kinase B,AKT）的表达变化。结果：构建的重组腺病毒载体 Ad5-Eag1-shRNA 具有良好的感染效能。感染Ad5-Eag1-shRNA 可沉默骨肉瘤中 Eag1的表达并能有效地抑制骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长（均 P ＜0.001）,同时下调裸鼠骨肉瘤组织中 MVD 密度和 VEGF 的表达（均 P ＜0．001）。感染 Ad5-Eag1-shRNA 可下调骨肉瘤细胞中 VEGF 的表达（P ＜0.05）并抑制 PI3K 和 AKT 的磷酸化（均 P ＜0．001）。结论：沉默 Eag1可能通过调控 VEGF ／PI3K／AKT 信号通路抑制骨肉瘤增殖和血管生成。     

雷帕霉素抑制人骨肉瘤MG-63细胞周期的实验研究

目的观察雷帕霉素对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖、周期及Cyclin D1基因表达的影响,探讨雷帕霉素抑制骨肉瘤细胞周期的可能机制。方法体外培养骨肉瘤MG-63细胞,用不同浓度的雷帕霉素（1、10、25nmol／L）干预MG-63细胞。采用水溶性四唑盐WST-8比色法检测MC-63细胞增殖的变化;流式细胞仪检测MG-63细胞周期;RT—PCR及免疫细胞化学SABC法检测MG-63细胞Cyclin D1基因表达的变化。结果雷帕霉素能显著抑制MG-63细胞增殖,呈时间依赖性,差别有显著性意义（P〈0．05）;流式细胞分析显示雷帕霉素能显著抑制细胞周期,使GO／G1期细胞增多（P〈0．05）;RT—PCR检测显示雷帕霉素对MG-63细胞Cyclin D1 mRNA表达无明显影响（P〉0．05）;免疫细胞化学分析雷帕霉素能显著抑制Cyclin D1蛋白的表达,差别有显著性意义（P〈0．05）。结论雷帕霉素能下调MG-63细胞Cyclin D1蛋白的表达,抑制MG-63细胞增殖及细胞周期。     

miRNA-95在骨肉瘤组织中的表达及其对MG-63细胞增殖和侵袭的影响

目的：研究miRNA-95在骨肉瘤组织和细胞株中的表达情况及其对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡、细胞周期和侵袭 能力的影响。方法：以实时荧光定量PCR检测15例骨肉瘤组织及其癌旁组织（标本收集自2015年1月至2018年1月青岛市海 慈医疗集团外科手术的病例）和骨肉瘤细胞株（MG-63、 U2OS、143B和HOS）与正常人成骨细胞株hFOB1.19中的miRNA-95表 达。利用Lipofectamine 2000将miRNA-95 mimics和miRNA-95 inhibitors分别转染至人骨肉瘤MG-63细胞株中,并设置miRNANC对照组,CCK-8法检测各组细胞增殖活力变化,流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡变化,Transwell方法检测各组细胞侵袭 能力变化,双荧光素酶活性实验检测并验证miRNA-95在MG-63细胞中的靶向基因。结果：miRNA-95在人骨肉瘤组织中的表 达水平显著高于癌旁组织（P<0.01）, 在MG-63、 U2OS、143B和HOS细胞中的表达水平显著高于hFOB1.19,且在MG-63细胞中表 达水平最高（P<0.01）。与miRNA-NC对照组相比,miRNA-95 mimics组中MG-63细胞的增殖活力显著上升、细胞凋亡率显著下 降而侵袭率显著上升（均P<0.01）、 而miRNA-95 inhibitors组中MG-63细胞增殖活力显著下降、细胞周期被阻滞、细胞凋亡率显著 上升而侵袭率显著下降（均P<0.01）;miRNA-95在骨肉瘤MG-63细胞中靶向上皮膜蛋白-1（epithelial membrane protein-1,EMP-1） 基因发挥作用。结论：miRNA-95在人骨肉瘤组织和细胞中均呈高表达,抑制骨肉瘤MG-63细胞中miRNA-95表达能够促进细 胞凋亡进而抑制细胞增殖、细胞周期及侵袭能力,该作用可能通过靶向EMP-1基因而发挥。     

Kv1.3钾通道在骨肉瘤中的表达及作用研究

目的 探讨特异性短发卡RNA（shRNA）抑制Kv1.3钾通道对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting和免疫组化检测骨肉瘤MG-63细胞中Kv1.3钾通道的表达,并分别采用CCK-8法、裸鼠骨肉瘤异种移植模型和流式细胞仪检测MG-63细胞增殖、生长和凋亡的变化,采用Western blotting检测MG-63细胞中多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和caspase-3的表达水平。结果Kv1.3钾通道在骨肉瘤细胞中异常高表达。沉默Kv1.3钾通道的Ad5-Kv1.3-shRNA能从体内外有效地抑制MG-63细胞增殖并促进其早期凋亡。沉默Kv1.3钾通道可明显诱导细胞凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的裂解。结论Kv1.3钾通道参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡的过程,有望成为骨肉瘤治疗及诊断的新靶点基因。     

蛋白激酶Cδ失活对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响

目的 探讨短发夹RNA（shRNA）靶向沉默人蛋白激酶Cδ（PKCδ）对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。方法 根据Genbank数据库中PKCδ序列,设计、合成互补并特异性编码其 shRNA序列（PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2）,克隆至pRNA6-1-Neo质粒载体后采用Western blotting检测PKCδ蛋白水平,筛选抑制效果最好的shRNA片段转染骨肉瘤干细胞（转染组）,设阴性对照组（转染shRNA无意义随机阴性对照序列）和空白对照组（不行转染处理）。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染后的细胞凋亡和细胞周期情况,实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达,采用Western blotting检测各组转染96 h后PI3K／Akt及Wnt／β-catenin信号通路中相关蛋白的水平。结果 转染PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2后PKCδ蛋白水平均降低（P＜0.05）,且PKCδ-shRNA-1的抑制效果优于PKCδ-shRNA-2,故后续实验选择PKCδ-shRNA-1;与其余两组相比,转染组的增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bax、Bad的mRNA水平均升高,而Bcl-2水平降低,且在细胞周期上,G0／G1期细胞比例升高,但S期和G2／M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;转染组PI3K／Akt通路中的PTEN水平升高、Akt水平降低,Wnt／β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低（P＜0.05）。结论 通过shRNA抑制PKCδ基因表达可抑制骨肉瘤干细胞增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对PI3K／Akt和Wnt／β-catenin信号通路激活有一定抑制作用,可能对骨肉瘤的防治有一定价值。     

Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响

[目的]利用RNA干扰（RNAi）技术观测其对白血病K562细胞cyelin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒．通过壳聚糖介导转染K562细胞，Western blot分析检测转染前后cyclin D1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。[结果]构建靶向cyclinD1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshRNA-575）经壳聚糖转染后，能显著抑制cyelin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；细胞阻滞于G0／G1期，细胞凋亡明显。而m—pshRNA-790质粒并无上述生物学效应：[结论]cyclinD1基因表达下调可抑制K562细胞生长影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡提示，因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

MicroRNA-145对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响

背景与目的 MicroRNA145(miRNA145)是microRNA家族中的重要一员,已被证实在多种肿瘤细胞中呈现低表达,并认为miRNA 145作为一种抑癌基因可以影响肿瘤细胞的生长和侵袭能力,但其在骨肉瘤中的作用未见相关报道.该研究旨在探讨miRNA145对骨肉瘤细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响.方法 用脂质体法将miRNA145真核表达质粒瞬时转染入人骨肉瘤细胞(MG63),实验设置空白对照组、空载体转染组和miRNA145质粒转染组3组,转染后荧光显微镜下观察转染效率,实时定量RT-PCR检测各组细胞miRNA145的表达,MTT增殖实验检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡率.结果 转染后miRNA145质粒转染组细胞增殖速度明显下降,细胞周期停止在G1期之前,凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miRNA145可以有效地抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

骨肉瘤MG-63细胞中Survivin的表达及其反义寡核苷酸对细胞增殖与凋亡的作用

目的 探讨Survivin在骨肉瘤细胞中的表达及Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 设计针对Survivin的ASODN和正义核苷酸（SODN）序列,制备脂质体-寡核苷酸复合物并转染MG-63细胞,分为空脂质体（Lip）组、脂质体介导的SODN（Lip-SODN）组和脂质体介导的ASODN（Lip-ASODN）组。采用免疫细胞染色法检测MG-63细胞中Survivin的表达情况,Western blotting检测各组转染48h后的Survivin蛋白水平,MTT法检测转染24、48和72h后MG-63细胞的增殖情况,流式细胞仪检测转染48h后MG-63细胞的凋亡情况。结果 Survivin主要表达于MG-63细胞的胞核。Lip-ASODN组的Survivin蛋白水平均低于Lip-SODN组和Lip组。不同浓度Survivin ASODN对MG-63细胞的增殖抑制程度不同,Lip-ASODN组的细胞增殖抑制率高于Lip组,且呈浓度依赖性;而Lip-SODN组的增殖抑制率与Lip组的差异无统计学意义（P＞0.05）。Lip-ASODN组的凋亡率为（88.47±0.79）％,高于Lip组的（10.01±0.90）％和Lip-SODN组的（4.12±0.25）％,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 靶向Survivin的ASODN可以显著抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力,并促进其凋亡。     

大蒜素对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

目的观察大蒜素对人成骨肉瘤细胞株MG-63增殖和凋亡的影响。方法不同浓度的大蒜素作用于体外培养的MG-63细胞,倒置显微镜下观察MG-63细胞的形态学变化,采用CCK-8法检测大蒜素对MG-63细胞增殖抑制能力,吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色及Annexin V-FITC标记流式细胞术检测细胞凋亡情况以及对MG-63细胞周期影响。结果大蒜素可抑制人成骨肉瘤细胞株MG-63细胞增殖,具有明显剂量和时间依赖性,10 μg/ml大蒜素可明显诱导MG-63细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G2/M期。结论大蒜素能够诱导MG-63细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞增殖。     

RNA干扰Livin 基因表达增强骨肉瘤MG-63 耐药细胞对多柔比星的化疗敏感性

目的：研究凋亡抑制蛋白基因Livin 在逆转骨肉瘤耐药中的作用。方法：应用多柔比星逐步诱导法诱导人骨肉瘤MG-63 细胞建立耐药细胞株,MTT实验检测耐药细胞株的耐药指数,Western blotting 法检测MG-63 细胞和耐药细胞中Livin 蛋白表达的差异。构建Livin shRNA 真核表达载体,应用LipofectmineTM 2000 转染至耐药骨肉瘤细胞中,Real-time PCR 和Western blotting 分别检测Livin shRNA转染前后MG-63 耐药细胞中Livin 基因和蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,MTT法检测对多柔比星化疗敏感性的变化。结果：成功构建重组质粒pSilencer3.1-H1 neo-Livin si。诱导的耐药细胞MG-63/R 对多柔比星的耐药指数为81.32±5.33。Livin shRNA可抑制MG-63 细胞中Livin 基因和蛋白表达,明显低于空白对照组和非特异性转染组（分别下调72%和69%,P<0.05）。特异性转染Livin shRNA组MG-63/R 细胞的凋亡率显著高于未转染组和非特异性转染组[(22.4±3.2)% vs (4.2±1.1)% 、(4.7±0.6)%,P<0.05]。3 组细胞在加入多柔比星后增殖均受到不同程度的抑制,且呈明显的时间-效应关系,但特异性转染组细胞的存活率均显著低于其他两组（P<0.05）。结论：应用RNA干扰技术下调Livin 的基因表达可有效促进耐药MG-63 骨肉瘤细胞的凋亡,从而增加其对化疗药物的敏感性。     

siRNA靶向抑制RPL6基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制核糖体蛋白L6（RPL6）基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响。方法 优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制RPL6基因的siRNA载体片段（siRPL6-1、siRPL6-2）分别高效转染人宫颈癌HeLa细胞（抑制组）,同时设转染无义序列（siControl）的空转染组及不进行任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测RPL6表达水平以筛选抑制率高的siRPL6载体用于后续实验。噻唑蓝比色（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况, Western blotting检测各组转染96 h后的cyclin A、CDK2和p21CIP1表达情况。结果 抑制组的RPL6 mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,siRPL6-2片段的干扰效率高于siRPL6-1,故后续实验选择siRPL6-2片段;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G0／G1期细胞比例升高,但S期和G2／M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制组转染后的p21CIP1水平升高,cyclin A和CDK2 水平降低,与空转染组和对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。空转染组和对照组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过siRNA抑制RPL6基因表达可抑制增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对宫颈癌防治有一定价值。     

SIRT6调控细胞糖代谢对非小细胞肺癌A549细胞放射敏感性的影响#br# #br#

目的 探讨沉默信息调节蛋白6（SIRT6）调控细胞糖代谢对非小细胞肺癌A549细胞放射敏感性的影响。方法 构建过表达SIRT6的腺病毒载体Ad SIRT6,采用荧光实时定量PCR（QPCR）检测经不同转染强度（0、25、50、100、200 pfu／细胞）Ad SIRT6转染24 h后的SIRT6 mRNA水平;根据实验设计分为对照组、空载体（Ad-null）组及过表达（Ad-SIRT6）组,Ad-null组和Ad SIRT6组的病毒浓度均为200 pfu／细胞;采用克隆形成实验检测3组经0、2、4、6、8和10 Gy X线照射后的存活分数（SF）,根据多靶单击模型绘制细胞存活曲线并计算增敏比（SER）;流式细胞术检测3组经4 Gy X线照射48 h的细胞周期和凋亡情况;采用QPCR检测经4 Gy X线照射48 h各组丙酮酸激2（PKM2）、乳酸脱氢酶A（LDHA）和己糖激酶（HK）的表达水平;葡萄糖试剂盒检测转染12、24、36、48 h后的培养基葡萄糖消耗水平。结果QPCR检测显示,在25～200 pfu／细胞的范围内,随转染强度的增加,A549细胞的SIRT6 mRNA水平升高（P＜0001）,0、25、50、100、200 pfu／细胞对应的SIRT6 mRNA水平依次为1.012±0.016、1.356±0.185、2.243±0.695、4.887±1.169和7.241±1.425,50、100、200 pfu／细胞对应的SIRT6 mRNA水平均高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。后续实验选择过表达效果最强的200 pfu／细胞转染量。克隆形成实验显示,Ad null组和对照组经0、2、4、6、8、10 Gy X线照射后SF的差异无统计学意义（P＞0.05）;而Ad SIRT6组经4～10 Gy X线照射后的SF均低于Ad null组和对照组（P＜005）。多靶单击模型拟合细胞存活曲线提示SER为1.76。与对照组和Ad null组比较,Ad SIRT6组的G0／G1期细胞比例和凋亡率升高,S期细胞比例及PKM2、LDHA和HK mRNA水平均降低,差异有统计学意义（P＜005）;Ad SIRT6组转染12、24、36、48 h的葡萄糖消耗量降低,低于对照组和Ad null组（P＜0.05）。结论 SIRT6过表达可抑制A549细胞糖酵解过程中关键酶生成来抑制糖酵解过程,同时具有放射增敏作用,并可导致G0／G1期阻滞和细胞凋亡。     

沉默HOXC10基因促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其机制

目的:探讨沉默同源框C10（Homeobox C10,HOXC10）基因表达对骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法:采用脂质体转染法将特异性针对HOXC10基因的shRNA转入骨肉瘤MG-63细胞（HOXC10-shRNA组）,同时以转染Scramble-shRNA作为对照组（Scramble-shRNA组）,分别应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HOXC10 mRNA及蛋白的表达水平。转染处理后,分别采用CCK-8法及FCM法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制率及凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测HOXC10、ATM和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)及凋亡相关蛋白Survivin和Caspase-3的表达水平。结果:HOXC10-shRNA转入MG-63细胞后,HOXC10 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均<0.05）。与Scramble-shRNA组细胞活力（0.95±0.12）%和凋亡率（4.35±0.52）%相比,HOXC10-shRNA组细胞活力（0.38±0.06）%明显下降,细胞凋亡率为（18.19±3.76）%明显升高（P均<0.05）;ATM/NF-κB信号通路中相关蛋白ATM、NF-κB及Survivin的表达水平均明显下调（P均<0.05）,而Caspase-3表达明显上调（P<0.05）。结论:沉默HOXC10基因表达后可抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控ATM/NF-κB信号通路的活化相关。     

shRNA靶向沉默P2X7R表达对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及PI3K／Akt和Wnt／β-catenin通路的影响

目的 探讨靶向P2X7受体（P2X7R）的小发夹RNA（shRNA）对人鼻咽癌HONE1细胞增殖、凋亡及信号通路的影响。方法 根据预实验结果优化shRNA转染条件,将2条靶向抑制P2X7R基因的shRNA载体片段（shRNA-1、shRNA-2）分别高效转染HONE1细胞,同时设转染无义序列（Blank）的空转染组及不进行任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测P2X7R表达水平以筛选抑制率高的转染载体用于后续试验。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡率,QPCR法检测各组凋亡相关基因的mRNA水平,Western blotting检测各组转染96 h后磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）通路和Wnt／β-连接素（β-catenin）通路中的蛋白变化。结果 转染组的P2X7R mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,且选择干扰效率高的shRNA-1载体进行功能学研究;与空转染组和对照组比较,shRNA-1转染组的HONE1细胞增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bid、Bax的mRNA水平均升高,而抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1的mRNA水平均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;与对照组比较,shRNA-1转染组处理后PI3K／Akt通路中PTEN蛋白水平均升高,而p-Akt水平均降低（P＜0.05）,Wnt／β-catenin通路中p-β-catenin、Cyclin D1和C-myc水平均降低（P＜0.05）。结论 通过shRNA抑制P2X7R基因表达可抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导凋亡,可能与抑制PI3K／Akt、Wnt／β-catenin通路有关,对鼻咽癌的防治有一定价值。     

蛋白激酶D抑制剂SD-208对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨蛋白激酶D抑制剂SD-208对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用5、10、20、30 μmol／L SD-208处理非小细胞肺癌细胞A549（设不加SD-208仅添加完全培养基组为对照组）,分别在24、48、72 h 3个不同刺激时间点应用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测A549细胞的吸光值并计算增殖抑制率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）双染色法结合流式细胞术检测不同浓度SD-208处理A549细胞24、48 h后的细胞凋亡情况,PI染色法流式细胞仪检测分析不同浓度SD-208处理A549细胞48 h后细胞周期时相分布情况;Western blotting检测不同浓度SD-208处理48 h后的细胞周期蛋白A（Cyclin A）、Cyclin D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）和p16蛋白的表达水平。结果 SD-208 可抑制A549细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）;SD-208处理后A549细胞的凋亡率及G0／G1期细胞比例均高于对照组,而S、G2／M期细胞比例均低于对照组,各浓度间的差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组比较,SD-208处理后的Cyclin D1和CDK4蛋白水平降低,p16蛋白水平升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。SD-208处理对A549细胞Cyclin A和Cyclin E蛋白水平无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SD-208可抑制A549细胞增殖并诱导细胞凋亡及G0／G1期阻滞,其机制可能与其影响细胞周期及相关调控蛋白水平有关。     

下调miR-23a对EGFR突变非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药的影响研究

目的 探讨抑制miR-23a对EGFR T790M突变非小细胞肺癌H1975细胞吉非替尼耐药性的影响及其可能机制。方法 选取吉非替尼耐药的对数生长期H1975细胞为研究样本,合成miR-23a抑制物（miR-23a inhibitor）,应用脂质体转染H1975细胞以抑制其miR-23a表达（抑制组）,同时设未经转染处理的非转染组和转染无关序列的阴性对照组,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证转染效果;采用CCK-8法检测转染24、48、72及96 h后各组的增殖情况,同时于转染48 h后用吉非替尼（0.03～300 μmol／L）处理各组细胞以评价对吉非替尼的药物敏感性变化情况;分别用流式细胞术检测各组的凋亡率（FITC-Annexin V／PI双染）和细胞周期（PI单染）情况,免疫印迹法检测各组多药耐药相关蛋白1（MRP1）、肺耐药相关蛋白（LRP）及谷胱甘肽转移酶π（GST-π）的表达变化。结果 抑制组在转染24～96 h出现miR-23a水平的持续下降,其miR-23a水平均低于其余两组,转染 96 h后的miR-23a水平分别为非转染组的（32.06±4.68）％和阴性对照组的（31.77±3.18）％,且吉非替尼对抑制组的半数抑制浓度（IC₅₀）为（2.82±0.46）μmol／L,均低于其余两组,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组相比,抑制组转染后增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期比例均升高,S期、G2／M期比例均下降且耐药蛋白MRP1、LRP及GST-π蛋白水平亦下调,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 下调miR-23a可逆转H1975细胞的吉非替尼耐药性,同时可抑制细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞,可能与降低耐药蛋白表达有关。     

miRNA-223对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨microRNA-223（miR-223）在非小细胞肺癌（NSCLC）A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DDP耐药肺腺癌细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-223的水平,将A549／DDP细胞分为3组：对照组、空转染组（转染无关序列）和抑制组（转染miR-223 inhibitor）,于转染24、48、72及96 h后分别采用qRT-PCR和CCK-8法检测转染效果及细胞增殖情况,CCK-8法评价转染后A549/DDP细胞对DDP的药物敏感性变化,采用流式细胞术检测转染48 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,Western blotting检测转染48 h后耐药基因蛋白P 糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及肺耐药相关蛋白（LRP）的表达。结果 A549／DDP细胞中的miR-223水平较高,为A549细胞的（7.14±0.26）倍（P＜0.05）;抑制组转染后的miR-223水平降低,转染96 h后的miR-223水平分别降至对照组的（67.15±2.84）％和空转染组的（65.80±3.47）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期细胞比例均升高,而S和G2／M期细胞比例及3种耐药基因蛋白水平均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。DDP对抑制组细胞的半数抑制浓度（IC50）值为（15.67±1.30） μg／ml,低于对照组的（33.71±2.61） μg／ml（P＜0.05）。结论 miR-223可增加A549／DDP细胞对DDP的耐药性,可能与耐药基因蛋白表达上调有关;降低miR-223水平可抑制A549／DDP细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞,并下调耐药蛋白的表达,从而增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性。     

RNA干扰Dub3表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制去泛素化酶3（Dub3）基因表达对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制Dub3基因的siRNA载体片段（siRNA-1、siRNA-2）分别高效转染人鼻咽癌CNE-2细胞,同时设转染无义序列的空转染组及无任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR（qPCR）检测Dub3表达水平以筛选抑制率高的感染载体用于后续试验。噻唑蓝法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,采用Western blotting检测各组转染96 h后细胞分裂周期蛋白25A（Cdc25A）的表达情况。结果 转染组的Dub3 mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,且选择干扰效率高的siRNA-1载体进行功能学研究;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G0/G1期细胞比例升高,但S期和G2/M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制组转染后的Cdc25A 水平降低,与空载体组和对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。空载体组和对照组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过siRNA抑制Dub3基因表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对鼻咽癌的防治有一定价值。