反向遗传学策略及其在寄生虫研究中的应用

由基因结构认识基因功能的科学称为反向遗传学。随着越来越多生物的基因组序列被阐明,研究基因功能的反向遗传学已成为生物学领域的热点。反向遗传学所运用的技术也在不断地发展与成熟,如基因敲除、反义核酸等均对基因功能鉴定起到一定的作用。尤其是近五、六年内兴起的RNA干扰技术,其作为一种简单有效的代替基因敲除的反向遗传学的研究工具,在后基因组时代寄生虫的大规模基因功能研究中,具有广阔的应用前景。此外,选择适合的模式生物研究反向遗传学技术,也是研究的一个重要方面。     

基因组修饰研究的策略

人类基因组计划的完成使人类对自身奥秘的探索进入了一个全新的阶段。但人类基因组计划本身并没有说明太多的问题 ,大量的人类基因组“诠释”工作 (基因功能研究 )才是意义之所在。研究基因功能的方法有多种 ,而最为直接 ,也是最为可靠的则是对基因组的直接修饰 :即转基因和基因敲除。由于具有饲养方便、繁殖迅速、与人类基因组的相似性高等特点 ,小鼠已成为研究哺乳动物基因功能的理想模型动物。与此相对应 ,近年来已发展了一系列关于构建转基因小鼠和基因敲除小鼠的策略和方法。利用这些方法产生了数以千计的转基因小鼠和基因敲除小鼠 ,为…     

基因敲除技术在2型糖尿病研究中的应用

基因敲除技术是研究基因功能的重要手段，近年来该技术在糖尿病的研究领域中得到普遍应用，尤其是条件性基因敲除技术的出现，进一步深化了糖尿病候选基因的在体研究。本文介绍基因敲除的基本原理及各种单基因、多基因、组织特异性基因敲除的2型糖尿病动物模型。     

RNAi技术及其在寄生虫相关基因功能研究上的应用

RNAi是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。它通过dsRNA介导的特异性降解相应序列的mRNA，从而导致转录后的基因沉默。目前已在线虫、果蝇、锥虫、真菌、小鼠及植物等生物中建立RNAi技术。其可以作为一种简单有效的代替基因敲除的分子遗传的研究工具，在后基因组时代寄生虫的基因功能研究和药物开发中具有广阔的前景。     

基因敲除技术与疟原虫基因功能研究

基因敲除(gene knockout)技术是近年发展起来的分子生物学技术。其原理是利用活细胞基因组DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,对预先选择的目的基因进行定点修饰以达到改变基因组某一特定基因的目的。由于恶性疟原虫和伯氏疟原虫在红细胞内培养技术和稳定转染技术的发展,使基因敲除技术在上述两种疟原虫的基因功能、蛋白质功能研究中的作用日益受到重视。本文仅就该技术在疟原虫研究中的应用、进展及存在的问题做一综述。     

RNAi技术及其在寄生虫相关基因功能研究上的应用

RNAi是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。它通过dsRNA介导的特异性降解相应序列的mRNA ,从而导致转录后的基因沉默。目前已在线虫、果蝇、锥虫、真菌、小鼠及植物等生物中建立RNAi技术。其可以作为一种简单有效的代替基因敲除的分子遗传的研究工具 ,在后基因组时代寄生虫的基因功能研究和药物开发中具有广阔的前景     

基因敲除技术在2型糖尿病研究中的应用

基因敲除技术是研究基因功能的重要手段 ,近年来该技术在糖尿病的研究领域中得到普遍应用 ,尤其是条件性基因敲除技术的出现 ,进一步深化了糖尿病候选基因的在体研究。本文介绍基因敲除的基本原理及各种单基因、多基因、组织特异性基因敲除的 2型糖尿病动物模型。     

RNAi技术在胰腺癌研究中的应用进展

在后基因组时代，基因功能的研究以前所未有的速度快速发展，各种研究基因功能的新技术不断涌现。RNA干扰（RNA interference，RNAI），一种新的、强有力的研究工具，在功能基因组学领域具有巨大的应用潜力。所谓RNAi就是利用双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程，即诱导序列特异的转录后基因沉默（PTGS）。RNAi技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的工具，迅速成为基因功能研究的有力工具以及最有潜力的基因干预治疗方法，     

研究基因功能的RNA干扰技术

人类基因组计划的实施 ,使基因组大规模测序工作已深入开展 ,人类积累了大量的基因序列数据 ,而这些序列大部分缺乏明确的功能注释 ,随着后基因组时代的到来 ,加速基因功能的研究已成为当务之急。人们对于某个基因功能的认识一方面通过分离突变体与野生型进行比较来确定 ,另一方面通过如反义抑制、目的基因超表达导致的共抑制等反向遗传学方法获得。而RNAi以其可大规模确定基因功能的优点 ,使其成为高通量分析日益增多的“新”基因的有效手段。1　RNAi的发现及特点很长时间以来 ,RNA仅仅被认为或者是作为mRNA分子起作用 ,或者作为翻译…     

反向遗传学在轮状病毒研究中的应用

针对病毒的反向遗传技术可以在基因水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,通过观察病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而达到研究病毒及其致病机制的目的。反向遗传技术在RNA病毒的研究中应用广泛,借助反向遗传技术调控病毒基因表达、揭示病毒蛋白功能已较为普遍,尤其是通过基因操作人工“合成”病毒的感染性克降一直是近年来反向遗传学研究的热点领域。目前轮状病毒的反向遗传操作仅限于借助辅助病毒实现部分基因节段的修饰和替换,尚没有拯救完整病毒的报道。本文就反向遗传技术在RNA病毒拯救,特别是轮状病毒研究中的应用与进展作一简要综述。     

CRISPR基因组编辑技术在结核分枝杆菌中的研究进展及应用

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的结核病仍然是全球公共卫生的威胁。为了应对此挑战，开发新型抗结核疫苗和药物刻不容缓，因此，需要对结核分枝杆菌基因功能进行更加全面深入的了解。基于CRISPR-Cas系统的基因组编辑技术已经广泛应用于原核及真核生物中，然而直到近年来才在结核分枝杆菌中得到发展和应用。笔者综述了基于CRISPR的基因组编辑技术在结核分枝杆菌中的研究进展以及在实际工作中的应用，重点总结了CRISPR全基因组敲除和抑制文库筛选在结核分枝杆菌遗传及化学-遗传相互作用研究中的应用，旨在加深对结核分枝杆菌基因编辑的认识并促进结核分枝杆菌的基础研究。     

基因打靶技术在寄生虫学研究中的应用

基因打靶技术(gene targeting),又称基因敲除(gene knockout)是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是在生物体内诱发精确、定向的基因删除或替代,从而对细胞基因组进行定位、定量的改变.目前基因打靶已经被证明为精确修饰基因组比较有效的方法.     

反向遗传学技术对呼吸道病毒研究的促进作用

反向遗传学技术,即病毒的全长感染性cDNA克隆技术,它解决了对RNA病毒基因组难以操作这一多年难题。由于多数呼吸道病毒属于RNA病毒,因此反向遗传学技术在深入研究呼吸道病毒基因组结构功能、研制筛选候选疫苗株等方面显示出非常好的应用前景。本文就呼吸道病毒反向遗传学技术的建立及应用进展进行了综述。     

一种新的基因灭活工具——甲基化寡核苷酸技术

后基因组时代的分子生物学研究重点转向了基因功能的研究.基因功能研究中涉及到对过度表达的基因进行抑制或者灭活.本文简要回顾和评价了基因敲除、反义寡核苷酸技术和RNA干扰技术等常用的基因灭活工具,着重对有可能成为第四代基因灭活工具的甲基化寡核苷酸技术,从产生背景、作用机制、技术路线、应用现状及前景等方面进行了详细的论述。以期引起注意和重视.     

结核分枝杆菌基因敲除技术的研究进展

结核分枝杆菌是十分重要的人兽共患病原菌,基因缺失株的构建在该菌致病与免疫机制、基因功能解析和防控技术中意义重大,而该菌特有的复杂结构和生理生化特性也给缺失株的构建带来难度,为此有关结核分枝杆菌基因敲除技术的研究一直是重要课题。本文重点介绍了结核分枝杆菌基于特异性转导噬菌体、线性DNA片段、反选择标记、CRISPR技术以及ORBIT系统的基因敲除方法,同时对分枝杆菌的分子遗传操作发展进行了展望。     

CRISPR/Cas9系统在寄生虫领域的研究进展

CRISPR/Cas9是一种有效的基因组靶向修饰系统,能够实现对基因组特定位点的基因敲除、定点插入和基因修复等遗传操作,为寄生虫的基因功能分析、药物靶点和疫苗分子筛选等研究提供了技术创新平台。本文对CRISPR/Cas9系统的原理及其在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)和利什曼原虫(Leishmania)等重要寄生虫研究中的新进展进行综述,分析讨论现阶段该系统在寄生虫研究应用方面存在的问题和优化策略。     

恶性疟原虫热休克蛋白86(HSP86)基因置换型和插入型打靶载体的构建

目的 对恶性疟原虫热休克蛋白基因进行体外扩增,构建ＨＳＰ８６基因打靶载体,利用基因敲除技术进行恶性疟原虫热休克蛋白基因功能的研究。方法 恶性疟原虫体外培养,基因组ＤＮＡ提取,目的基因扩增,载体与目的片段连接、阳性克隆筛选及酶切鉴定。结果 经酶切鉴定ＰＣＲ产物及插入片段大小与预期值相符,进一步测序鉴定证实ＰＣＲ产物及插入片段为所需目的基因片段。插入片段经酶切鉴定证实插入方向正确。结论 成功构建了用于     

RNA干扰技术及其在寄生虫研究中的应用

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是双链RNA（dSRNA）介导的序列特异靶基因转录后基因沉默的过程。RNAi天然存在于各种生物体中,如果蝇、线虫、原生动物、脊椎动物、高等植物等,在保持基因组的纯洁、抵抗病毒的入侵、控制生物发育、染色体的异染色质化等方面都具有非常重要的作用。自1998年Fire等首次将RNAi现象定义为转录后基因沉默（PTGs）后,应用RNAi技术进行基因功能的研究迅速在各种生物中开展起来。本文就RNAi技术及其在寄生虫领域中的研究结果作一综述。     

恶性疟原虫半胱氨酸蛋白酶falcipain-1非红内期疟原虫所必需

恶性疟原虫半胱氨酸蛋白酶falcipains是抗疟化学药物的新靶标之一。Falcipains由红内期疟原虫表达，包括falcipain-1，falcipain-2和falcipain-3。对falcipain-2和falcipain-3的功能研究表明，二者均是食物泡血红蛋白酶，参与降解恶性疟原虫滋养体的血红蛋白。由于缺乏合适的表达系统，falcipain-1的功能尚未研究清楚。Puran等应用基因敲除技术获得falcipain-1基因敲除恶性疟原虫，通过比较观察falcipain-1的抑制剂YA29（据报道能特异地阻止裂殖子的红细胞入侵）和其他蛋白酶抑制剂对野生型疟原虫（WT）和falcipain-1基因敲除疟原虫的抑制作用，来评价半胱氨酸蛋白酶falcipain-1的基因功能。     

基因微阵列技术和炎症性关节炎

基因微阵列(microarray)检测技术伴随着对人类基因组及其编码的蛋白的相关结构和功能的深入研究，从最初基因的cDNA微阵列，到蛋白微阵列技术等正在迅速发展和广泛应用。我们知道，大多数生物学过程是一个涉及疾病相关基因的识别、量化和蛋白质分子相互作用的复杂网络，关于基因功能