乳腺癌p16基因甲基化及与蛋白表达的关系

目的:探讨散发性乳腺癌中p16基因异常甲基化状况及其与蛋白表达的关系,进而研究散发性乳腺癌中p16基因异常的表遗传学作用。方法:用甲基化特异PCR(MSP)和SP法研究68例乳腺癌组织及相应癌旁正常组织中p16基因启动子甲基化状况及蛋白表达情况。结果:p16基因在68例散发性乳腺癌组织中的甲基化率为29%,且其甲基化与肿瘤组织分型、患者居住地及淋巴结转移相关(P<0.05),而与肿瘤患者绝经与否及组织分级无关(P>0.05);P16蛋白在所有肿瘤标本中的表达下降率为51%,在相应癌旁组织中均呈阳性表达,二者有显著性差异(P<0.05),P16蛋白表达下降与肿瘤患者淋巴结转移及患者居住地明显相关(P<0.05),与患者绝经、组织分级和分型无关(P>0.05);在20例p16甲基化的癌组织标本中,P16蛋白表达下降率(95%),显著高于48例未发生甲基化的乳腺癌标本下降率(33%),两者有显著性差异(P<0.05),乳腺癌患者组织p16基因甲基化检出率与P16蛋白表达下降率具有良好的一致性(Kappa=0.506),而p16未发生甲基化的正常乳腺组织和乳腺良性病变组织其蛋白均呈阳性表达。结论:在散发性乳腺癌中p16启动子甲基化改变会明显降低P16蛋白表达,p16基因启动子甲基化是其蛋白表达下降的重要原因,这种机制更倾向于农村乳腺癌患者。     

甲状腺增生性疾病中p16^INK4a基因甲基化及其表达

目的 研究甲状腺增生性疾病中p16^INK4a基因的甲基化状况及其与表达之间的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测45例甲状腺增生性疾病（15例甲状腺乳头状癌,17例甲状腺腺瘤,13例结节性甲状腺肿）样本中p16^INK4a蛋白的表达;采用甲基化特异性PCR检测p16^INK4a基因的甲基化状况.采用RT-PCR检测其中10例甲状腺增生性疾病（3例甲状腺乳头状癌,5例甲状腺腺瘤,2例结节性甲状腺肿）中p16^INK4a mRNA的表达.结果 45例甲状腺增生性疾病样本中,8例检测到p16^INK4a基因异常甲基化,19例p16t^INK4a蛋白表达阳性;p16^INK4A基因异常甲基化与其蛋白表达之间呈负相关（r=-0.293 4,P=0.038 7）.10例甲状腺增生性疾病样本中,5例检测到转录产物;p16^INK4A基因异常甲基化与其转录水平之间呈负相关（r=-0.6547,P=0.04）.结论 p16^INK4a基因甲基化与p16^INK4a基因失活有关,但并不与失活完全一致;p16^INK4a基因甲基化可能在甲状腺增生性疾病中起作用.     

人群胃黏膜不确定性异型增生和异型增生组织p16甲基化及与幽门螺杆菌等暴露因素相关分析

目的:比较胃黏膜不确定异型增生和异型增生组织p16基因甲基化状态,分析其与幽门螺杆菌(Helico-bacter pylori, Hp)感染等暴露因素的相关关系.方法:选取我国北方胃癌高发区(山东省临朐县)223例不确定性异型增生和130例异型增生胃黏膜,采用甲基化特异性聚合酶链反应和变性高效液相色谱技术,测定p16基因CpG岛甲基化状态,并与年龄、性别、吸烟、饮酒、Hp感染进行多因素分析.结果:胃黏膜不确定性异型增生和异型增生p16甲基化阳性率分别为28.3%和24.6%(P=0.46).p16甲基化与年龄、性别、吸烟、饮酒均不存在相关关系(P>0.10).单因素分析发现,在异型增生组织中p16甲基化与Hp感染接近统计学相关(P=0.07),Hp阳性者(93例)甲基化相对危险度高于阴性者(37例)(OR=2.62,95%CI:0.92～7.43),多因素分析则二者无统计学关联(P=0.11).结论:胃黏膜不确定性异型增生与异型增生p16甲基化频率相似;p16甲基化与年龄无相关关系:Hp感染可能与p16甲基化密切相关.     

宫颈癌p16基因甲基化研究新方法

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测宫颈癌p16基因甲基化的方法，以期达到早期诊断宫颈癌。方法正常基因组DNA经修饰后进行PCR，构建含有DNA甲基化β-aetin的重组质粒，克隆阳性质粒作为标准品用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR进行检测，建立检测的标准曲线。利用建立好的方法进行检测临床60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5’CpG岛甲基化状态。结果结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化，60例宫颈癌标本的甲基化率为28．33％（17／60）。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR用于p16基因甲基化检测为宫颈癌的早期诊断提供了一种有效的方法。     

胃癌组织中p16基因甲基化分析

目的：探讨抑癌基因p16在胃癌组织中是否存在甲基化异常及其与胃癌发生发展的关系。方法：对20例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织应用于甲基敏感酶（HpaⅡ）和甲基非敏感酶（MspⅠ）酶切,结合PCR扩增技术,对p16基因外显子1、外显子2的二核苷酸胞嘧啶特定序列5‘-CCGG-3‘位点甲基化进行检测。结果：20例胃癌组织中,p16基因外显子1、2异常甲基化分别为5例（25％）和9例（45％）,正常组织未发现甲基化异常;14例高甲基化标本中,中分化胃癌4例,低分化7例,高分化1例,有2例存在外显子1、2同时甲基化异常,二者均为低分化胃癌,进展期胃癌（Ⅲa,Ⅳ期各1例）中1例呈现泳动易位;外显子2甲基化异常多发生于晚期肿瘤患者（P＜0．05）。结论：p16基因甲基化异常可能会造成基因功能丧失,从而失去了对细胞增殖的负性调控作用,导致胃癌发生与进展;外显子2高甲基化与临床进展有关,可能为晚期事件。     

无机砷对人支气管上皮细胞p16基因甲基化及表达的影响

目的 观察亚砷酸钠（NaAsO2)和胂酸肽（Na3AsO4)对人支气管上皮BEP2D细胞p16基因甲基化及表达的影响。方法 采用甲基化特异性PCR（MSP）及RT－PCR等技术观察分析BEP2D细胞p16基因甲基化和表达水平。结果 （1）NaAsO2(0.016-2μmol/L）和高浓度组Na3aSo4(80和160μmol/L）具有促进BEP2D细胞p16基因二核苷酸CpG岛甲基化作用;而低浓度组Na3AsO4(20和40μmol/L）不能使BEP2D细胞p16基因CpG岛发生甲基化。（2）无机砷可使BEP2D细胞p16基因表达下降,且NaAsO2较Na3AsO4更为明显。结论 无机砷可引起BEP2D细胞p16基因CpG岛甲基化程度增高和表达水平下降,提示p16基因高甲基化是无机砷致癌的可能途径之一。     

甲状腺增生性疾病中p16INK4a基因甲基化及其表达

目的 研究甲状腺增生性疾病中p16~(INK4a)基因的甲基化状况及其与表达之间的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测45例甲状腺增生性疾病(15例甲状腺乳头状癌,17例甲状腺腺瘤,13例结节性甲状腺肿)样本中p16~(INK4a)蛋白的表达;采用甲基化特异性PCR检测p16~(INK4a)基因的甲基化状况.采用RT-PCR检测其中10例甲状腺增生性疾病(3例甲状腺乳头状癌,5例甲状腺腺瘤,2例结节性甲状腺肿)中p16~(INK4a) mRNA的表达.结果 45例甲状腺增生性疾病样本中,8例检测到p16~(INK4a)基因异常甲基化,19例p16t~(INK4a)蛋白表达阳性;p16~(INK4A)基因异常甲基化与其蛋白表达之间呈负相关(r=-0.293 4,P=0.038 7).10例甲状腺增生性疾病样本中,5例检测到转录产物;p16~(INK4A)基因异常甲基化与其转录水平之间呈负相关(r=-0.6547,P=0.04).结论 p16~(INK4a)基因甲基化与p16~(INK4a)基因失活有关,但并不与失活完全一致;p16~(INK4a)基因甲基化可能在甲状腺增生性疾病中起作用.     

卵巢癌组织中p16基因甲基化的研究

目的 探讨抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化在卵巢癌癌变过程中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测17例卵巢癌样本中p16基因启动子区域(M1／U1)以及启动子和第—个外显子5’端部分(M2／U2)的甲基化状态。结果 在我们检测的17例卵巢癌样本中，有3例M1阳性，阳性率为17．65％(3／17)，这些病例恶性度较低。无1例M2阳性。结论 抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌的癌变过程，它可能与其它抑癌基因协同作用。     

p16基因甲基化在肺癌诊断中的研究进展

肺癌是目前发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,约占所有肿瘤的12.4%,且5年生存率低于15%[1].目前80%的肺癌患者在明确诊断时已失去了手术治疗的意义,因此,早期诊断是目前大幅度提高肺癌治愈率和患者生存率的有效手段,但目前尚未找到一种较为满意的方法.随着相关研究的发展,现已证实肿瘤抑制基因p16基因因其外显子区域的甲基化而致基因的失活与肺癌的发生发展密切相关[2],此为肺癌的早期诊断提供了一种新的可能路径.本文就此作一综述.     

癌组织中p16基因甲基化分析

目的探讨抑癌基因p16在胃癌组织中是否存在甲基化异常及其与胃癌发生发展的关系.方法对20例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织应用甲基敏感酶(HpaII)和甲基非敏感酶(MspI)酶切,结合PCR扩增技术,对p16基因外显子1、外显子2的二核苷酸胞嘧啶特定序列5'-CCGG-3'位点甲基化进行检测.结果20例胃癌组织中,p16基因外显子1、2异常甲基化分别为5例(25%)和9例(45%),正常组织未发现甲基化异常;14例高甲基化标本中,中分化胃癌4例,低分化7例,高分化1例;有2例存在外显子1、2同时甲基化异常,二者均为低分化胃癌,进展期胃癌(Ⅲa、Ⅳ期各1例)中1例呈现泳动易位;外显子2甲基化异常多发生于晚期肿瘤患者(P<0.05).结论p16基因甲基化异常可能会造成基因功能丧失,从而失去对细胞增殖的负性调控作用,导致胃癌发生与进展;外显子2高甲基化与临床进展有关,可能为晚期事件.     

p16基因异常甲基化与人类肿瘤发病的关系

p16位于人类染色体9p21，由3个外显子和2个内含子组成。p16基因的功能产物P16蛋白能与周期蛋白(cyclin)竞争结合细胞周期素依赖激酶(CDK4、6)结合，从而抑制细胞周期素D与CDK复合物的活性，使Rb磷酸化受阻。E2F不能游离，因而不能发挥促进G期→S期转化的作用,细胞增殖受到控制。p16对细胞的生长抑制作用是依赖于Rb基     

原发性肝癌患者血清p16基因甲基化与AFP、CEA的分析

[目的]分析原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血清中p16启动子区域甲基化的改变状况及其AFP、CEA临床意义的比较。[方法]运用甲基化特异性PCR技术，检测64例HCC患者血清D16基因启动子区域甲基化的改变情况，并分析与AFP、CEA敏感性、特异性的关系。[结果]HCC患者血清D16基因甲基化检出率为76．6％（49／64），而正常对照组和良性肝部疾病组血清未检出D16基因甲基化，AFP阳性检出率81．3％（52／64），CEA阳性检出率21．9％（14／64）。[结论]D16基因检出启动子区域异常甲基化是HCC辅助诊断的分子标志物之一。三者联合检测对肝癌诊断有实用价值。     

p16基因甲基化特异检测方法的建立及其初步应用

目的：建立p16基因中CpG岛的甲基化分析方法，即甲基化特异的PCR（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）方法及其初步应用。方法：用亚硫酸氢钠修饰变性后的被测DNA，随之进行甲基化，非甲基化特异的PCR扩增。应用MSP法分析白血病患者的白细胞p16基因5'CpG岛的甲基化变异情况。结果：用加热法变性DNA，亚硫酸氢盐修饰DNA,Wizard DNA纯化树脂除盐，纯化修饰后的DNA都获得了成功，并建立了MSP分析p16基因甲基化的方法。白血病患者的白细胞p16基因的5'CpG岛有一定比2例的甲基化变异。结论：MSP是一种较为简便，敏感，且具有高度特异性的检测任何基因的CpG区域甲基化位点的分析方法。     

p16基因甲基化在非小细胞肺癌的表达研究

目的：探讨p16基因甲基化在人非小细胞肺癌组织中的表达情况。方法：应用甲基化特异性PCR法（MS-PCR）检测45例非小细胞肺癌组织,21例肺良性疾病组织中p16基因甲基化的表达情况。结果：肺良性疾病中p16基因甲基化阳性率为14．3％,低于癌组织中的57．8％,差异有统计学意义（P=0．001）;p16基因甲基化与非小细胞肺癌细胞分化程度及淋巴结转移情况有明显的相关性（P〈0．05）。结论：p16基因甲基化的表达情况与非小细胞肺癌的发生、发展有关。     

甲基化特异性PCR检测胃癌p16基因甲基化及其临床意义

目的初步探讨甲基化特异性聚合酶链反应（MSPCR）在胃癌临床诊断中的应用价值。方法选取47例胃癌患者的癌组织及配对的癌旁组织，11例远离肿瘤的正常胃黏膜组织。标本经一般处理，PCR扩增后，产物经电泳EB染色，紫外灯下观察。结果47例胃癌组织标本中，22例（46．2％）在p16基因的启动子区域呈现异常甲基化；47例癌旁组织标本中，28例（58．6％）也检测出甲基化存在；11例正常胃黏膜组织标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论MSPCR技术对胃癌患者组织标本中的异常甲基化检测具有高度特异性，是一项具有潜力的胃癌早期诊断新技术。     

急性淋巴细胞白血病中p16基因甲基化及表达

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病发生机制中的作用。方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应(PCR)方法检测82例急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况，同时应用免疫组织化学染色法检测p16蛋白的表达。结果：31例急性淋巴细胞白血病患者存在p16基因的甲基化；1例p16基因纯合缺失；39名患者p16蛋白表达阴性；p16蛋白阴性表达患者的初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16蛋白阳性表达者。结论：p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病的发生机制中有一定的作用，p16蛋白可能是评估急性淋巴细胞白血病预后的一个指标。     

原发性肝癌患者血清p16基因启动子甲基化的分析

目的：分析原发性肝癌(PLC)患者血清中p16启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义。方法：运用甲基化特异性PCR技术，检测64例PLC患者血清p16基因启动子区域甲基化的改变情况，并分析与临床病理资料的关系。结果：PLC患者血清p16基因甲基化检出率为76．6％(49／64)，而正常对照组和良性肝病组患者血清未检出p16基因甲基化，p16基因甲基化检出率与乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、疾病分期及转移状态无明显关系。结论：p16基因检出启动子区域异常甲基化是PLC早期辅助诊断的分子标记物之一。     

巢式甲基化特异性PCR检测p16基因的研究

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性.方法应用巢式甲基化特异性PCR技术(Nested-MSP)及甲基化特异性PCR(MSP),检测了结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因的异常甲基化情况;比较MSP及Nested-MSP两方法的灵敏度.结果应用MSP方法,Dukes A、B期病人和Dukes C、D期病人p16启动子区甲基化率分别为23.8%和59.4%;应用巢式-MSP方法,甲基化率上升至52.4%和84.4%.结论巢式-MSP的灵敏度明显高于普通的MSP技术,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为辅助结直肠癌诊断的有效方法之一.     

肺癌病人痰细胞中p16基因高甲基化分析

目的　分析肺癌病人痰标本中p16基因启动子区域异常高甲基化的改变情况 ,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标记物的价值。方法　运用半巢式甲基化特异性PCR技术 ,检测 94例原发性肺癌病人痰标本和部分对应肿瘤组织 ,以及 10例慢性炎病例痰标本中p16基因启动子区域的甲基化改变。结果　 74%的肺癌病人痰标本中检测到了p16基因异常高甲基化 ,与传统细胞学相比 ( 4 6.8%) ,痰标本中p16基因异常高甲基化对肿瘤的检出率灵敏度更高 (P <0 .0 1) ;痰细胞中p16甲基化检测和细胞学相结合 ,对肿瘤的检出率可达 86.17%( 81 94)。如果痰标本中p16基因启动子区域发生高甲基化 ,其对应的肿瘤组织中p16基因亦为高甲基化。 10例慢性炎病人痰标本中仅 3例检测出p16基因甲基化。结论　痰标本中p16基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效分子生物标记物之一。