Fos蛋白参与牙髓炎疼痛中枢调控作用的实验研究

目的:研究大鼠实验性牙髓炎疼痛诱导Fos蛋白表达与其靶基因脑啡肽前体mRNA转录、脑啡肽水平改变之间的关系,探讨牙痛的中枢调节机制。方法:应用免疫组化方法观察Fos蛋白在三叉神经脊束核尾侧亚核(sp5c) 内的表达、原位杂交技术检测PENKmRNA的转录和放射免疫技术测定sp5c内ENK含量的变化。结果:实验性牙髓炎疼痛诱发Fos蛋白在sp5c内的表达呈时间依赖性,Fos蛋白在诱痛后015h表达,2h达高峰,4h后渐减弱; PENKmRNA在牙痛后2h始转录,4h达高峰,8h后渐减弱。牙髓炎诱痛后4h sp5c内ENK含量显著升高(P<0101)。结论:Fos蛋白通过激活靶基因脑啡肽前体基因的转录,引起中枢内脑啡肽水平的升高而参与牙痛的中枢调节。     

P物质对培养成纤维细胞c-fos、c-jun表达的影响

目的　研究P物质刺激体外培养成纤维细胞后转录因子c fos、c junmRNA及其蛋白在不同时相点表达的规律 ,探讨c fos、c jun在P物质调控创面愈合中的信号转导作用。方法　采用Wistar大鼠肉芽组织成纤维细胞体外培养模型 ,设立实验组和对照组 ,分别用原位杂交和SABC免疫组化方法检测P物质刺激后c fos、c junmRNA及其蛋白表达的变化规律及特征。结果　P物质刺激后c fos、c junmRNA及其蛋白表达增加 ,其中c fos、c junmRNA在刺激后 1h达峰值 ,Fos蛋白在刺激后 2h达峰值 ,Jun蛋白在刺激后 3h达峰值。结论　P物质可以上调c fos、c junmRNA及其蛋白的表达 ,提示原癌基因c fos、c jun可能是P物质调控内源性生长因子表达的又一核转录因子     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞表达IL-8和MCP-1 mRNA的影响

目的：在转录水平上观察牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）表达白细胞介素-8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响。方法：厌氧培养Pg，原代培养HUVECs，RNA抽提，逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和mRNA比色定量法检测IL-8和MCP-1基因表达。结果：HUVECs基础表达IL-8和MCP-1mRNA,Pg以剂量依赖的方式增强IL-8和MCP-1mRNA的表达，Pg感染后1hIL-8mRNA开始增高，3h达到高峰，并持续到5h。而MCP-1的mRNA从Pg感染后1h开始增高，3h达到高峰，5h出现下降趋势。结论：Pg在转录水平上增强UHUVECs表达IL-8和MCP-1，这种上调作用可能是牙周病早期基因水平调控炎症细胞募集的重要因素，可能是牙周疾病的炎症反应和免疫反应中主要调控机制之一。     

急性牙髓炎致敏时Vc核c-fos蛋白的时程变化

目的:研究大鼠急性牙髓炎造成中枢致敏时三叉神经脊束核尾侧亚核(caudal part of spinaltrigeminal nucleus,Vc)内c-fos蛋白的变化情况。方法:建立大鼠急性牙髓炎模型,利用免疫组化实验检测不同时间点Vc核c-fos蛋白变化情况,采用单因素方差分析比较不同时间点的变化情况。结果:在封药后12h至24h,Vc核c-fos阳性神经元表达数目显著增多。结论:Vc内c-fos蛋白的变化时程与牙髓炎进展密切相关。     

实验性牙移动三叉神经节内降钙素基因相关肽改变

目的：观察实验性牙移动后,初级感觉神经元兴奋性递质降钙素基因相关肽（CGRP）的改变。分析正畸疼痛时,初级感觉神经元痛信号发生、传导及敏感化机制。方法：制备大鼠实验性牙移动动物模型,采用免疫荧光染色法和RT-PCR法分别观察不同时间点三叉神经节内CGRP免疫阳性结构的改变及CGRP mRNA表达的变化。结果：实验性牙移动后,实验侧三叉神经节（TG）内CGRP-ir节细胞以及CGRP mRNA的表达强于对侧。结论：实验性牙移动后,初级感觉神经元中痛感受兴奋性神经递质CGRP的合成、表达增加。表明实验性牙移动影响了初级感觉神经元痛信号的发生、传导,使之致敏。     

重离子辐照对舌癌Tca8113细胞中转移相关基因RhoC的作用

目的：：探讨重离子辐照对舌癌侵袭转移相关基因RhoC的作用。方法：应用不同剂量重离子束(12 C6+)对体外培养的舌癌Tca8113细胞进行辐照,采用荧光实时定量PCR法及Western Blot法观察细胞中RhoC mRNA及蛋白的表达变化。结果：与空白对照组比较,12C6+辐照后4h,各实验组细胞中RhoC mRNA的表达降低(P<0.05);辐照后12 h,2 Gy及4 Gy组细胞中RhoC mRNA表达增加,随后各组细胞中RhoC mRNA表达再次下降(P<0.05);辐照后12 h,细胞中RhoC蛋白表达量随辐照剂量的增加而增高,在4 Gy时达到高峰;24 h后随剂量的增加逐渐降低;在相同辐照剂量下,细胞中RhoC蛋白的表达随时间推移呈下降趋势,RhoC蛋白表达和RhoC mRNA表达的趋势相同。结论：12 C6+重离子束可以下调舌癌Tca 8113细胞中RhoC基因的表达。     

大鼠急性牙髓炎造成中枢致敏时三叉神经脊束核极间亚核和孤束核c-fos蛋白的时程变化

目的:研究大鼠急性牙髓炎造成中枢致敏时三叉神经脊束核极间亚核(interpolar part of spinal trigeminal nucleus,vi)和孤束核(nucleus tractus solitafius,NTS)内c-fos蛋白的变化情况.方法:建立大鼠急性牙髓炎模型,利用免疫组化实验检测不同时间点Vi核和NTS核c-fos蛋白的变化情况,采用单因素方差分析比较不同时间点的变化情况.结果:封药后12h至24h,Vi核c-los阳性神经元表达数目明显增多;而双侧NTS内的c-fos阳性神经元数目在6h时最多,随后逐渐减少.结论:延髓内c-fos蛋白的变化时程与牙髓炎进展密切相关.     

上颌第一磨牙咬合升高对蓝斑Fos、OX42和GFAP表达的影响

目的：探讨脑桥蓝斑内神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞是否参与咬合升高后信息的传递。方法：64只雄性大鼠随机分为正常对照组（n=8）、假操作对照组（n=8）和咬合升高刺激组（n=48）。咬合升高刺激组大鼠双侧上颌第一磨牙咬合升高约0．5mm，以成活时间（1、2、4、8、24、72h）又分为6个亚组（每个亚组8只）。常规固定、取材、恒冷箱切制含脑桥蓝斑的脑桥吻侧冠状切片（片厚30μm），进行抗Fos-OX42或抗GFAP免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。结果：正常对照组和假操作对照组没有差异，合并为对照组。对照组Fos表达很稀疏，实验组Fos表达明显增加，2h达到高峰，然后下降。对照组OX42和GFAP表达很微弱，不同时间点没有明显变化，但实验组OX42和GFAP在8h出现明显增强的阳性反应，24h达到高峰，72h下降。结论：咬合升高激活蓝斑内神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，它们可能参与咬合升高后伤害性信息传人中枢的处理。     

活化卫星胶质细胞参与牙髓炎症及痛觉过敏的实验研究

目的:观察大鼠实验性牙髓炎过程中三叉神经节GFAP的表达变化,探讨三叉神经系统通过卫星胶质细胞活化反应参与牙髓炎症及痛觉过敏的潜在机制。方法:建立大鼠牙髓炎动物模型,应用免疫荧光染色及RT-PCR半定量分析方法,从细胞水平及mRNA水平检测三叉神经节中GFAP的动态表达。结果:大鼠牙髓炎症24 h后,三叉神经节内可见GFAP免疫阳性卫星胶质细胞围绕在神经元周围,形成典型的环状结构。RT-PCR半定量分析结果显示,GFAP的mRNA表达水平于炎症24 h达峰值。结论:三叉神经系统通过卫星胶质细胞活化反应参与牙髓炎症及痛觉过敏的发生和发展。     

Cyclin D1反义寡核苷酸对Tca8113/CDDP细胞基因转录表达的影响

目的：构建细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的反义寡核苷酸真核表达载体,并检测其转染Tca8113／CDDP细胞系后的表达情况。方法：以Tca8113／CDDP细胞总RNA为模板,应用RT-PCR法扩增cyclinD1全长．通过克隆至pUCm-T载体中,测序完全正确;经IPrG诱导,可正确表达蛋白。上下游分别利用HindIII和EcoRI的酶切位点插入真核表达载体pcDNA3．1,测序鉴定;并构建表达cyclin D1反义寡核苷酸的2个重组载体,通过Lipofectamine将其导入Tca8113／CDDP细胞系中,G418筛选获得阳性稳定表达细胞系：通过RT-PCR、免疫组化检测cyclin D1基因转录和蛋白表达。结果：成功构建pcDNA3．1-cyclin D1真核表达载体,分别命名为pcDNA3．1空载体（Co）、cyclin D1 mRNA 5’端为靶区的反义载体(C5’)、cyclin D1 mRNA 3’端为靶区的反义载体(C3’)、cyclinD1正义载体(CDl)。3’端反义寡核苷酸转染细胞后,cyclin D1 mRNA表达水平降低58．8％,mRNA5’端反义寡核苷酸组无明显抑制。免疫组化结果显示,转导正义寡核苷酸组cyclin D1阳性表达为最高,转导mRNA3’端、mRNA5’端反义寡核苷酸组为弱阳性表达。结论：cyclin D1 mRNA3’端反义寡核苷酸能明显抑制cyclin D1在Tca8113／CDDP中的表达,为进一步研究逆转Tca8113／CDDP耐药性提供了实验工具。     

诱导型一氧化氮合酶基因转染兔牙周膜细胞的瞬时表达检测

目的检测含有人诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因的重组质粒pEGFP-iNOS体外转染兔牙周膜细胞后的瞬时表达情况,为动物牙周局部导入外源性iNOS基因奠定实验基础。方法通过脂质体介导将重组真核质粒pEGFPiNOS转染兔牙周膜细胞,在荧光显微镜下观察瞬时转染情况。并在转染后12 h与48 h,应用实时定量PCR检测iNOS基因的转录,Western免疫印迹技术检测iNOS蛋白表达。设空质粒转染组和空白组为对照。结果重组质粒转染后12 h即可观察到荧光蛋白的表达,pEGFP-iNOS转染组细胞中有iNOS mRNA转录及iNOS蛋白的表达。结论iNOS基因成功导入兔牙周膜细胞,瞬时转染后可在基因和蛋白水平检测到外源性基因的表达。在兔牙周组织导入iNOS基因从而诱导NO生成是具有可行性的。     

细胞骨架完整陛在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达中的作用

目的探讨细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达中的作用。方法原代培养BALB／c小鼠颅骨成骨细胞,采用细胞松弛素D（CD）破坏细胞骨架完整性：以12dyne／cm2的流体剪切力对成骨细胞加载1．5h;分别应用实时荧光定量巢式PCR和免疫荧光的方法检测COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平．并对结果进行双因素方差分析。结果采用CD破坏细胞骨架完整性．可以对流体剪切力诱导成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达起拮抗作用（P〈0．05）：在无流体剪切力加载条件下,CD处理对COX-2mRNA和蛋白的表达水平无显著影响（P〉0．05）;流体剪切力加载1．5h能使成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达水平显著升高（P〈0．05）;CD处理可显著降低流体剪切力诱导成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达水平（P〈0．05）。结论保持细胞骨架完整性是流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达过程中所必需的。     

釉蛋白在大鼠牙胚发育过程中的转录表达

目的　观察釉蛋白在大鼠牙胚发育过程中的转录表达 ,为进一步研究釉蛋白的生物学功能提供基础。方法　采用原位杂交方法 ,检测出生后 1、3、7、10、14d龄大鼠第一磨牙牙胚中釉蛋白mRNA的表达。结果　大鼠出生后 1～ 10d在成釉细胞和成牙本质细胞中均检测到釉蛋白mRNA的表达。在成釉细胞中的表达随细胞的分化、基质分泌具有规律性 ,1d已有微弱表达 ,3d表达增强 ,7d达到最强 ,10d减弱 ,14d为阴性。釉蛋白mRNA在成牙本质细胞中的表达 1d很微弱 ,14d阴性 ,3～ 10d为持续的中等强度的表达。结论　釉蛋白在成釉细胞中的转录表达从前成釉细胞一直持续到成熟期 ,至牙冠硬组织发育完全时中止。成牙本质细胞也表达釉蛋白基因 ,提示釉蛋白可能参与早期罩牙本质的形成     

Toll样受体2激动剂Pam3CSK4对人牙髓细胞表达细胞因子的影响

目的研究Toll样受体2（TLR2）激动剂Pam3CSK4对体外培养人牙髓细胞（hDPC）表达细胞因子的影响。方法特异性配体Pam3CSK4体外活化hDPC表面TLR2,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测不同时间处理后hDPC内白细胞介素6（IL-6）、IL-8、IL-1β及半胱氨酸-X-半胱氨酸趋化因子配体10（CXCLl0）mRNA的表达水平;双抗体夹心ELISA法检测上述细胞上清液中IL-6、IL-8蛋白的表达水平;激光共聚焦观察TLR2-核因子κB（NF-κB）信号通路关键蛋白p65的胞内分布情况。结果1μg／mlPam3CSK4处理hDPC0、4、8、12h,荧光定量PCR结果显示,除IL-6mRNA表达水平最先于4h达峰值外（P=0．006）,IL-8、IL-1β及CXCLl0mRNA表达水平均于4h开始升高．8h达峰值（P〈0．001）：双抗体夹心ELISA法显示,hDPC上清液中IL-6及IL-8的蛋白表达于4h开始升高．8～12h趋于平稳。激光共聚焦显微镜发现,表达绿色荧光的NF-κBp65蛋白主要位于对照组细胞质．经1μg／mlPam3CSK4刺激75min后转移至胞核。结论特异性配体Pam3CSK4通过结合hDPC表面TLR2启动细胞内NF-κB信号通路进而激活其转录作用．诱导hDPC表达多种细胞因子．从而参与牙髓炎的早期免疫调控。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对腺样囊性癌细胞 RECK 基因表达及细胞侵袭力的影响

目的：探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′deoxycytidine,5-aza-dC）对腺样囊性癌细胞中 RECK基因表达及肿瘤侵袭力的影响。方法：采用甲基化特异性 PCR、实时定量 PCR、Western 印记检测腺样囊性癌细胞中 RECK 基因的甲基化状态及 RECK 基因 mRNA 和蛋白的表达,transwell 体外侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果：RECK 基因甲基化条带仅在 ACC-M细胞中发现,经5-aza-dC 处理后 ACC-M细胞中 RECK 基因甲基化得到逆转,RECK 基因 mRNA 及蛋白的表达显著提升。ACC-M细胞的侵袭力明显降低。结论：5-aza-dC 可逆转腺样囊性癌 ACC-M细胞中 RECK 基因的高甲基化状态并恢复 RECK 基因 mRNA 及蛋白的表达,抑制 ACC-M细胞侵袭力。     

正畸力作用下大鼠牙周组织中CCR1及其相关配体的表达

目的 研究正畸力加力后CC类趋化因子受体1（CCR1）及其相关配体（CCL3、CCL5、CCL7）的mRNA在大鼠牙周组织中的表达变化规律,以探讨CCR1在正畸牙移动的作用.方法 将35只8周龄体重（220±25）g雄性SD大鼠随机分为7组,每组5只,空白对照组大鼠不安装实验装置,其余大鼠安装实验装置.安装实验装置大鼠随机选择一侧上颌第一磨牙为实验牙,对侧第一磨牙作为对照牙,采用镍钛拉簧建立大鼠正畸牙移动模型,力值50 g.实验动物分别于加力后0h、12h、1d、3d、7d、14 d处死,取大鼠上颌第一磨牙周围牙周组织应用实时荧光定量PCR法进行研究.结果 大鼠牙齿加力后,观察到牙周组织内CCR1及其配体的mRNA表达量呈现一定的时间规律：加力后12 h,CCR1、CCL3、CCL5、CCL7的mRNA表达均开始上升,CCR1 mRNA表达在3d达高峰（F=1.745,P=0.021）,CCL3、CCL5mRNA表达在1d达高峰（F=19.976,PCCL3 =0.019; F=17.114,PCCL5=0.008）,CCL7表达差异无统计学意义.CCR1及其配体的mRNA转录水平在加力时7d均下降至与对照组基本一致.结论 正畸力作用下,大鼠牙周组织中CCR1及其相关配体mRNA表达出现一过性变化,呈现短时上调规律,推测CCR1及其相关配体表达与正畸牙移动过程及牙周骨改建可能相关.     

体外rhIL—1β诱导髁状突软骨细胞HSP70的表达及其意义

目的 明确热休克蛋白70（HSP70）在人重组白细胞介素－1（rhIL-1β）刺激下对下颌骨髁状突软骨细胞的保护作用。方法 通过原代细胞培养获得兔髁状突软骨细胞,在生长良好的第三代软骨细胞中分别加入不同浓度的rhIL-1β,并利用原位杂交及免疫组织化学技术检测rhIL-1β处理软骨细胞后HSP70的表达变化。结果 正常髁状突软骨细胞胞浆内有HSP70蛋白弱表达,rhIL-1β（10ng/ml）作用12h后HSP70出现表达升高,部分细胞核内也可见表达,48h后信号开始减弱。HSP70mRNA的表达与蛋白表达基本一致。结论 一定浓度的rhIL-1β刺激髁状突软骨细胞可诱导HSP70的转录及蛋白合成,提示HSP70可能在骨关节炎症损伤中对软骨细胞起到保护作用。     

六亚甲基二乙酰胺对MEC—1细胞凋亡及bcl—2基因表达的影响

目的：研究分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺（hexamethylene bisacetamide,HMBA)诱导人粘液表皮样癌细胞系MEC－1细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响。方法：用2mmol/LHMBA和1mg/L5-FU对培养的MEC－1细胞进行体外诱导72h后,分别采用光镜。TUNEL染色、免疫组化,原位杂交、图像分析等方法进行凋亡指数、bcl-2蛋白及mRNA表达水平的检测。结果：HMBA诱导的MEC－1细胞凋亡指数为68．5％,明显高于对照组和5－FU组（P＜0．01）;bcl-2蛋白及mRNA的表 度均显著高于其它组（P＜0．01）。结论：HMBA对人粘液表皮样癌MEC－1细胞具有明显的诱导凋亡作用,其作用机制可能与减弱了凋亡相关基因bcl-2的负调控作用有关。     

非编码RNA与口腔颌面-头颈部癌研究

微小RNA(MicroRNA,miRNA)是非编码RNA(ncRNAs)中研究最广泛的一类,它们通过转录后调控基因的沉默,而达到调控基因从mRNA到蛋白的转录翻译。研究预测,miRNAs调控超过60%编码蛋白的转录,它们的功能涉及调控细胞增殖、分化和凋亡等生理过程,还涉及癌症的发生和发展。通过对口腔颌面部癌ncRNAs异常表达和作用的研究,有望促进分子诊断和治疗技术的发展。基于ncRNAs的定量检测和表达调控技术的应用,ncRNAs分子的生物学功能得以鉴定和明确。当然,ncRNAs的靶基因以及miRNAs与癌症关系的研究,还仅处在研究的初级阶段,对于ncRNAs的病理作用范围、作用机制的深入研究和进一步阐明,是未来研究的主要方向。     

硫代磷酸化反义寡核苷酸对耐放疗舌癌细胞MDR1基因和P-gp表达的抑制作用

目的：研究反义硫代磷酸化寡核苷酸（phosphorothioate antisense oligonuc leotide,PS—ASOs）抑制人舌癌细胞耐放疗株Tca 8113多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1,MDR1）以及MDR1蛋白（P-gp）表达的作用。方法：人工合成互补于MDR1基因mRNA特定片断的硫代磷酸化正反义寡核苷酸;PS—ASOs浓度分别为0．1μmol／L,0．25μmol／L,0．5μmol／L,以正义寡核苷酸作为实验对照,未转染的耐放疗组为空白对照,以5μl／ml脂质体Lipofectamine为载体转染耐放疗的Tca8113细胞株;逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）测定转染后MDR1 mRNA表达,流式细胞技术（FCM）测定细胞膜P—gp表达。结果：与正义组和空白对照组相比,转染PS—ASOs后12h,MDRI mRNA和P—gP表达降低,转染24h,各剂量组表达均降至最低,在转染48h后,基本恢复到转染前水平,而正义组和空白对照组在各时段及各剂量组均无统计学差异;双因素方差分析：PS—ASOs不同浓度（P=0．00）、不同作用时间仳0．00）对下调MDRI mRNA、P—gp表达差异显著,结论：PS—ASOs能降低MDR1基因以及蛋白的表达;PS—ASOs的作用具有浓度依赖性和时间依赖性。