结核分枝杆菌DNA指纹分析研究

目的：采用结核分枝杆菌IS6110－RFLP DNA分型的方法分析上海近年分离的部分结核分枝杆菌临床分离株，并进行分子流行病学分析。方法：提取结核分枝杆菌基因组DNA，纯化后经限制性内切酶PvuⅡ切割，琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后，用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交，以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号，比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型，分析各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型。结果：经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含9－21个IS6110拷贝,但有1菌株不含IS6110拷贝。另一株含1个IS6110拷贝。结论：结核分枝杆菌上海分离株指纹图谱呈高度多态性。零拷贝菌株和单拷贝菌株不能用IS6110－RFLP DNA指纹分析方法分析。     

PCR-RFLP分析16s-23srDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的探讨16S～23srDNA间区序列DNAPCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法对19种分枝杆菌标准株的16S～23SrDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSP1消化反应，分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异。结果，PCR扩增结果显示：分枝杆菌一般扩增出1～2条带，缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP，快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575bP，单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33．3％的受试菌种，酶切结果显示：分枝杆菌的酶切图谱彼此不同。结论16S～23SrDNA间区序列DNAPCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。     

芯片显色法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因实验条件优化研究

目的优化研究芯片显色法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因的最佳条件。方法自制DNA芯片,每条寡核苷酸探针片段长度为19bp,点样浓度在15μmol/L,以痰液为待检标本,分别用不同引物、Mg2 、核苷酸、DNA聚合酶浓度等进行多重聚合酶链反应;分别在不同时间、温度下进行杂交,分别在不同酶作用时间和显色时间进行分析,比较不同条件芯片检测结果。结果引物、Mg2 、核苷酸、DNA聚合酶浓度分别为0.2μmol/L、1mmol/L、0.2mmol/L、5U效果最好,杂交时间和杂交温度分别为0.5h、60℃信号最强,酶作用时间和显色时间均为0.5h时得到最佳结果。结论在最佳条件下,该技术的重复性、特异性、灵敏度与可靠性均较好,适合基层医院推广应用。     

耐药性结核分枝杆菌的分子生物学检测方法研究进展

结核病的重新流行使人类健康再次面临严重威胁,为提高抗结核药物的治疗效果,临床需要对结核分枝杆菌的耐药性进行快速鉴定。本文阐述了基于DNA测序技术(DNA直接测序、焦磷酸测序技术)、DNA扩增技术(包括巢式 PCR、PCR-SSCP 法、多位点酶切联合PCR-SSCP法、异源双链形成法、分子信标法等)、分子杂技术(包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析、多列探针检测法(LiPA)、基因芯片技术)和 DNA 信号放大技术等分子生物学检测方法在检测结核分枝杆菌耐药性方面的研究进展,以期为临床提供一定的方法参考。     

POR-RFLP分析16s～23s rDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的 探讨16s～23s rDNA间区序列DNA PCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值.方法 对19种分枝杆菌标准株的16s～23s rDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶Hae Ⅲ、MSP1消化反应,分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异.结果 PCR扩增结果显示:分枝杆菌一般扩增出1～2条带,缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP,快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575 bP,单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33.3%的受试菌种,酶切结果显示:分枝杆菌的酶切图谱彼此不同.结论 16s～23s rDNA间区序列DNA PCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法.     

分枝杆菌菌种鉴定DNA微阵列的初步研究与应用

目的制备快速鉴定分枝杆菌菌种的DNA微阵列。方法根据19种分枝杆菌标准株的16SRNA序列设计寡核苷酸探针,制备DNA微阵列,通过反向杂交技术鉴定19种分枝杆菌标准株、9种非分枝杆菌标准株和31株分枝杆菌临床分离株带荧光标记的PCR产物。结果该DNA微阵列与9种非分枝杆菌标准株不杂交,具有分枝杆菌特异性;可将19种分枝杆菌标准株鉴定到群或种,具有较高的分枝杆菌种特异性。应用PCR-SSCP分枝杆菌初步菌种鉴定方法对31株分枝杆菌临床分离株进行初步的鉴定,9株为结核分枝杆菌复合群和22株为非结核分枝杆菌。应用DNA微阵列进一步进行菌种鉴定,9株与探针a杂交阳性,为结核分枝杆菌复合群;2株与探针c杂交阳性,为胞内分枝杆菌;8株与探针d杂交阳性,为堪萨斯分枝杆菌或瘰疬分枝杆菌或猿猴分枝杆菌或胃分枝杆菌;1株与探针k杂交阳性,为戈登分枝杆菌;2株与探针p杂交阳性,为龟分枝杆菌脓肿亚种;2株与探针r杂交阳性,为偶然分枝杆菌;1株与探针s杂交阳性,为草分枝杆菌;2株与探针a和p杂交阳性,为结核分枝杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种复合感染株;1株与探针a和r杂交阳性,为结核分枝杆菌和偶然分枝杆菌复合感染株;3株与该芯片杂交阴性。2株临床分离株经基因测序也证实DNA微阵列鉴定的特异性。结论该DNA微阵列有可能简便、快速、准确地     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建

目的 构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒。观察其在抗结核杆菌感染中的预防保护作用。方法 从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后。定向插入pcDNA3.1( )中，结果 成功扩增出MPT64编码基因。经HindⅢ和BamHI酶切和PCR鉴定。MPT64基因正确插入pcDNA3.1( )中，DNA序列测定无突变产生。结论 成功地构建了结构分枝杆菌MPT64真核表达质粒。为进一步研究MPT64在抗结核杆菌感染中的预防作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒并表达。方法：从结核分枝杆菌（H37Rv）基因组中扩增出Ag85B编码基因，经限制性内切酶消化后，定向克隆入pcDNA3.1( )中。采用脂质体法将pcDNA/Ag85B转染COS－7细胞，采用RT－PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出Ag85B基因，经双向DNA序列测定，与Genbank注泵的序列一致；重组质粒转染COS－7细胞后经检测证实，该基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了pcDNA/Ag85B质粒，其在真核细胞中表达的蛋白具有良好的抗原性。     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。     

结核分枝杆菌药物敏感试验检测方法的研究

目的 建立一种结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）药敏试验的快速荧光检测法。方法 用自制的荧光检测管检测异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EB）、丁胺卡那霉素（AMK）、左旋氧氟沙星（LVFX）对结核分枝杆菌的体外抑菌活性,并用82例临床菌株与改良罗氏法进行了配对比较,确定各药物在药敏试验中的应用浓度。结果 5种药物的应用浓度分别确定为IHN：0．1μg／ml、RFP：1μg／ml、EB：2μg／ml、AMK：2μg／ml、LVFX：2μg／ml;本法进行结核分枝杆茼的药敏试验仅需7～10天（d）,较改良罗氏法的28d缩短了18～21d。两种方法的药敏试验结果无显著性差异。结论本法经济实用,并缩短了结核分枝杆菌药敏的报告时间。     

神经生长因子高亲和力受体互补核糖核酸探针的研究

目的 制备用地高辛标记的神经生长因子高亲和力受体(Trk A)正、反义互补核糖核酸(cRNA)探针的研究。方法 设计Trk A引物，构建pGEM-T Easy-Trk A重组质粒，分别用ApaI和SacI进行酶切得到线性DNA片段，以SP6和T7RNA聚合酶转录合成带有地高辛标记的高比活度的正、反义单链cRNA探针。结果 经斑点杂交证实，该探针敏感性高、特异性强。Trk A-ApaⅠ探针稀释12500倍后的浓度为40ng／μl；Trk A-SacⅠ稀释1：2500倍后的浓度为8ng/μl。结论 成功制备了地高辛标记的Trk A cRNA探针，为毒理学中有关Trk A mRNA在组织、细胞的表达和分布的研究提供了有效工具。     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因突变的研究

目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片。根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物，该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果120株结核分枝杆菌临床分离株中，35株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；85株耐乙胺丁醇临床分离株中有50株检测到embB基因突变[58．8％（50／85）]，均为306位密码子突变，该突变与PCR．SSCP和测序结果完全一致；85株耐药株中后有35株未检测到突变，占41．2％（35／85）。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株的embB基因突变，可协助临床医生制定合理的治疗方案，特别是复治患者，可帮助选择有效药物。     

红花随机扩增多态性DNA反应体系的建立与优化

目的：考察不同因素对红花随机扩增多态性DNA反应体系的影响，建立并优化反应体系。方法：提取红花基因组DNA，分别设计Taq酶浓度（三水平：0．02、0．04、0．06U／μL）、dNTP浓度（三水平：0．10、0．20、0．30mmol／L）和引物（primer）浓度（三水平；0．16、0．32、0．48pmol／L）的三因素实验，进行PCR扩增。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图确定最优的Taq酶浓度、dNTP浓度和引物浓度。进一步没计Mg^2＋浓度（三水平：1．0、1．5、2．0mmol／L）和模板浓度（四水平：1．00、1．25、1．50、1．75mg／L）的两因素实验，进行PCR扩增，确定最佳Mg^2＋浓度和模板浓度。结果：三因素实验中，第17条组合泳道和两因素实验中第6条组合泳道扩增主带稳定、均匀、清晰，条带数日多。结论：确定红花随机扩增多态性DNA反应25μL反应体系中最佳组合为：Taq酶0．04 U／μL、dNTP0．30mmol／L、引物0．32pmol／L、Mg^2＋ 1．5mmol／L、模板浓度1．00mg／L。     

斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的：为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法：将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和HindⅢ内切酶进行断链处理，电泳和序列分析并确定DNA片段长度，地高辛标记后制备成检测探针，测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果：HindⅢ内切酶处理断链后产生172bp、344bp、516bp、688bp不同长度的DNA，并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30s的DNA长度为500～750bp的DNA片断作为检测用探针。结论：两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0．1pg，重复性均较好，超声波处理的探针特异性优于酶切探针，并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。     

细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究

目的检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法分别分离16株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PCR扩增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型可在含利福平（4μg／ml）、异烟肼（0．2μg／ml）、乙胺丁醇（7．5μg／ml）的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示，结核分枝杆菌稳定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论结核分枝杆菌稳定L型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。     

荧光定量聚合酶链反应检测白细胞中结构分枝杆菌DNA

目的：检测外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA在肺结核诊断中的价值。方法：应用荧光定量聚合酶链反应技术，对95例肺结核患者外周血标本，84例肺结核患者痰标本进行了结核分枝杆菌DNA检测。结果：外周血、痰标本中，结核分枝杆菌DNA阳性率为85％和57％；对44例患者外周血、痰标本配对同时检测总阳性率可达91％。结论：荧光定量聚合酶链反应检测外周血白细胞中结核杆菌DNA用于肺结核的诊断，可提高肺结核诊断的敏感性和准确性，明显优于痰标本，可作为肺结核诊断较可靠指标。     

费安

[通用名称 ]　rifampicinandisoniazidtablets ,异福片。[异　　名 ]　卫非宁[理化性状 ]　本品除去薄膜衣后为橙红色或暗红色片剂。[药理作用 ]　本品为利福平和异烟肼的复方制剂。利福平对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌(包括麻风分枝杆菌等 )在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。异烟肼对各型结核分枝杆菌都有高度选择性杀菌作用 ,对生长繁殖期结核分枝杆菌作用强 ,对静止期作用较弱且慢。两者合用可以加强抗菌活性 ,并减少耐药菌株的产生。利福平与依赖于DNA的RNA多聚酶的 β亚单位牢固结合 ,抑制细菌RNA的合成 ,防止该酶与DNA连…     

异烟肼药物浓度及作用时间对结核分枝杆菌生长状态的影响

目的了解异烟肼药物浓度及作用时间对结核分枝杆菌生长状态的影响。方法29例结核分枝杆菌异烟肼敏感株与0．2μg／ml、1μg／ml、5μg／ml浓度异烟肼分别作用24h、48h、72h后，接种7H10固体培养基，37℃培养，观察异烟肼不同浓度、不同作用时间下结核分枝杆菌生长情况，以未与异烟肼作用的菌株作为对照；以初见菌落时间与第5周末菌落状态（包括菌落数量、大小、疏密程度）为观察指标，并将菌落数量、大小等设定等级给予相应分数得到每株菌的菌落状态评分；最终以平均初见菌落时间与5周末菌落状态平均分值作为考量指标。结果对照组平均初见菌落时间为12．48d，经0．2μg／ml、1μg／ml、5μg／ml浓度异烟肼作用24h时平均初见菌落时间比对照组分别延长3．80d、6．93d、7．55d，作用48h时分别延长9．90d、10．86d、12．45d，作用72h时分别延长9．31d、9．80d、12．18d；对照组5周末菌落状态平均分值为10．59，经0．2μg／ml、1μg／ml、5μg／ml浓度异烟肼作用24h时菌落状态平均分值比对照组分别减少2．04、3．79、3．9，作用48h时分别减少6．04、6．35、6．83，作用72h时分别减少5．66，6．25，6．76。结论异烟肼对结核分枝杆菌生长状态的影响与药物浓度的升高关系并不明显，但其影响随着药物作用时间的延长而显著，且在作用48h达到平台期。提示我们在临床用药中应考虑药物的抗菌后效应。     

SURVEYOR酶法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因突变的探讨

目的探讨SURVEYOR酶法在结核分枝杆菌耐药基因突变检测中的应用。方法结核分枝杆菌临床分离株60株,经测序证实有embB基因突变的乙胺丁醇耐药株45株,无基因突变的15株,采用SURVEYOR酶法进行检测。经PCR扩增,杂交形成异源双链,SURVEYOR酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的带形来判断有无突变存在。结果 45株耐药株均检出了存在突变,15株敏感株均无突变发现。SURVEYOR酶法与测序法的结果完全相符。结论 SURVEYOR酶法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因突变简便、稳定,灵敏度和特异性高,是结核分枝杆菌耐药基因检测较好方法。     

地龙ISSR-PCR体系的建立与优化

目的：确立地龙ISSR-PCR最佳反应体系。方法：通过单因素设计试验对影响ISSR--PCR的不稳定性因素进行处理与优化,其中包括模板DNA浓度的优化,ISSR引物的筛选以及其最佳退火温度的确定,从而确定了ISSR--PCR最佳反应体系。结果：模板DNA最佳浓度为10ng／μL,共筛选出7个地龙ISSR--PCR反应体系最佳引物及其最佳退火温度。结论：对地龙ISSR--PCR反应体系进行优化与建立,以更好地应用于地龙遗传多样性实验研究。