硒蛋白K基因干扰对T淋巴细胞内质网钙稳定蛋白的影响

目的探讨SelK mRNA干扰效果及其硒蛋白K(SelK)基因干扰后对细胞内质网钙稳态蛋白(endoplasmicreticulum calcium homeostasis protein,CHERP)的表达,观察T淋巴细胞内Ca~(2+)浓度的变化。方法从SelK m RNA(NM_019979.2)的编码序列中符合设计要求的靶位点设计特异性干扰SelK mRNA的RNAi片段,构建shRNA干扰载体靶向干扰SelK RNA,用核酸序列分析方法分析重组片段的正确性,利用荧光定量PCR和Westeron blot鉴定SelK mRNA的干扰效果,采用Real time-PCR的方法检测SelK干扰后细胞内的CHERP的变化。结果阳性重组载体可以被BamH I酶切。酶切片段序列分析重组子质粒结果与所设计片段完全一致,正确率为100.0%。三个ShRNA表现了不同的干扰效果,sh222、sh102和sh101的干扰效率分别为12.13%、16.46%和42.37%,在核酸水平上重组质粒sh101对SelK的干扰效果最佳,与sh222和sh102相比,差异有统计学意义(P0.01)。Western blot检测重组质粒sh101在蛋白水平上的干扰效率为45.4%,干扰组细胞中CHERP的表达与对照组相比抑制率达到40.0%。结论重组质粒sh101对SelK在核酸和蛋白质水平上都有较好的干扰效率,SelK干扰对细胞中CHERP的表达有抑制的作用,或因此打乱了内质网与胞质中的钙离子平衡,从而影响到了细胞内游离的钙离子浓度,是导致T淋巴细胞激活的因素之一。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1（interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1）基因的扩增、克隆及蛋白表达.方法以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序.进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件.结果含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000 bp.重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21（DE3）plysS中有融合蛋白表达.结论成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础.     

未折叠蛋白应答通路调控机制的研究进展及其临床应用前景

未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)是应激条件下细胞中内质网的一种保护性反应.在哺乳动物中,其主要通过内质网跨膜蛋白(IRE1、PERK及ATF6)转导的3条信号通路发挥效应,并依赖相关蛋白、因子进行正负反馈调控,以维持细胞功能正常.如果应激持续存在,UPR调控失衡,诱导细胞凋亡或死亡,引发相关疾病.不少研究选取UPR通路中的关键因子作为疾病治疗靶点,取得一些进展,提供了新的临床思路,具有广阔的应用前景.     

维替泊芬诱导子宫内膜癌细胞发生内质网应激及自噬相关蛋白表达

 目的 探究维替泊芬是否具有诱导多种子宫内膜癌细胞发生内质网应激及自噬的作用。方法 维替泊芬处理子宫内膜癌细胞系KLE、EFE184、NOU-1和SKUT-2,并分别使用二甲基亚砜（DMSO）、蛋白酶体抑制剂MG132、硼替佐米和光敏剂原卟啉处理细胞作为对照组。维替泊芬作用浓度为0.1~10 μmol/L,作用时间为0~48 h。光学显微镜和活细胞成像系统观察细胞形态,磺酰罗丹明B法测定细胞增殖能力。Western blot法检测内质网应激过程中相关蛋白质水平变化,免疫荧光法检测自噬小体。结果 MG132和硼替佐米抑制子宫内膜癌细胞增殖、诱导细胞肿胀与死亡,维替泊芬诱导细胞出现肿胀并死亡,而原卟啉无此作用。维替泊芬促进细胞中肌醇蛋白-1a减少、钙敏感伴侣蛋白增加、C/EBP同源蛋白（CHOP）增加、蛋白质二硫键异构酶降低。同时CHOP蛋白质水平受维替泊芬浓度和作用时间的影响,呈现双向性：当降低维替泊芬浓度同时增加作用时间时,CHOP蛋白质水平增加;当作用浓度在0~5 μmol/L时,CHOP蛋白质水平随维替泊芬浓度增加而增加,但当作用浓度提高至10 μmol/L时,CHOP蛋白质水平降低。维替泊芬促进细胞膜关键蛋白Rab11水平下降,细胞核出现形态皱缩,溶酶体增加。结论 维替泊芬可能通过诱导子宫内膜癌细胞发生内质网应激,引起细胞自噬,最终导致细胞死亡。     

脂蛋白脂肪酶基因敲除小鼠糖脂代谢与脂肪组织内质网应激研究

目的研究脂蛋白脂肪酶(LPL)基因敲除小鼠糖脂代谢特点及脂肪组织内质网应激情况。方法以LPL基因敲除杂合子小鼠(LPL+/-组,n=8)和野生型(WT)C57小鼠(对照组,n=8)作为实验对象,两组再分为16周龄组(n=4)和50周龄组(n=4)。测定血清三酰甘油(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平;腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)监测血糖变化,计算葡萄糖曲线下面积(AUCg)和稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),评价胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能;采用Real-Time PCR技术检测皮下脂肪和内脏脂肪组织中内质网应激相关因子(Bip、ATF4、ATF6和CHOP)的表达。结果 50周龄LPL+/-组小鼠血清TG和FFA水平均显著高于50周龄对照组小鼠,血清FFA水平明显高于16周龄LPL+/-组小鼠(P<0.05)。IPGTT结果显示:50周龄LPL+/-组小鼠IPGTT30、60 min血糖及AUCg均显著高于50周龄对照组(P<0.05),且IPGTT15～120 min血糖和AUCg均显著高于16周龄LPL+/-组(P<0.05)。与16周龄LPL+/-组比较,50周龄LPL+/-组小鼠HOM...     

牛蒡子苷通过抑制内质网应激减轻晚期氧化蛋白产物诱导的HK-2细胞间充质转分化

目的探讨牛蒡子苷对AOPPs诱导的肾小管上皮细胞EMT的影响及其机制。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞 （HK-2细胞）分为3组：牛血清白蛋白（BSA）组、AOPPs组、AOPPs+牛蒡子苷组,用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检 测细胞E-cadherin、vimentin和GRP78的蛋白和mRNA表达水平;以DCFH-DA为荧光探针,流式细胞术检测细胞内活性氧水 平。结果与BSA组相比,AOPPs组的上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的蛋白和mRNA表达水平下调、间充质细胞标志性蛋白 vimentin和内质网应激标志性蛋白GRP78的蛋白和mRNA表达水平上调、细胞内活性氧水平升高;与AOPPs组相比,AOPPs+ 牛蒡子苷组E-cadherin蛋白和mRNA表达水平上调、vimentin和GRP78的蛋白和mRNA表达水平下调、细胞内活性氧水平降 低。结论牛蒡子苷可能通过抑制内质网应激进而减轻AOPPs诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生,且氧化应激参与该过程。     

内质网膜蛋白复合物10(EMC10)的研究进展

 内质网膜蛋白复合物10（endoplasmic reticulum membrane protein complex subunit 10,EMC10）属于内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）家族,具有进化上的高度保守性。EMC10具有分泌型蛋白质和膜型蛋白质两种同源异构体,与糖代谢、肿瘤生长、神经系统疾病、心血管疾病、雄性不育等方面有关。本文就EMC10的基因和功能进行综述,为进一步研究EMC10在生命活动中的作用机制提供理论基础。     

内质网应激与氧化应激在百草枯致大鼠肺纤维化中的作用

目的 探讨百草枯(PQ)中毒大鼠肺纤维化与内质网应激(ERS)的关系.方法 40只sprague-dawley(SD)大鼠按随机数字表法分为对照组(8只)和染毒组(32只),20％PQ溶液灌胃后分别于1、7、14、21 d处死大鼠取肺组织,每个时间点处死8只.苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色观察肺组织病理变化;比色法检测肺组织丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)变化;免疫组织化学法检测肺组织中糖调节蛋白78(GRP78)表达情况.结果 HE和Masson染色结果证实成功复制肺纤维化模型;模型组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度较对照组严重.染毒后ld肺组织MDA及GRP78蛋白表达均较对照组明显升高[MDA:(1.51±0.12) nmol/mg vs.(0.81±0.04) nmol/mg;GRP78:(14.25±6.36)vs.(3.18±1.02);P＜0.05,P＜0.01],GRP78蛋白表达于染毒后7d逐渐下降.而染毒组肺组织SOD活性在各时间点均较对照组降低(P＜0.05).结论 PQ中毒大鼠肺ERS标志性蛋白GRP78明显升高,表明ERS在PQ中毒后肺纤维中发挥一定的作用.     

内质网应激标志性蛋白Caspase-12在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化逆转恢复模型中的作用研究

目的：探讨内质网应激( ERS)标志性蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12( Caspase-12)在大鼠肝纤维化形成与逆转恢复病程中的作用。方法建立四氯化碳( CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型,苏木精-伊红染色和Masson胶原纤维染色观察肝脏病理组织学改变;免疫组化法检测肝组织肝纤维化标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及钙激活蛋白酶( Calpain)的表达;Western blot检测不同时期肝脏组织中 Calpain、Cleaved-Caspase-12和 Cleaved-Caspase-3蛋白表达变化。结果肝脏病理组织学检测提示肝纤维化逆转恢复模型成功。免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝脏组织中α-SMA和Calpain抗原阳性细胞明显增多、着色明显加深,且多分布在肝实质肝细胞区域。逆转恢复期,α-SMA抗原表达阳性细胞与模型组比较逐渐下降。Calpain抗原表达阳性细胞主要分布在肝脏的小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位。 Western blot结果显示,模型组肝脏 Calpain、Cleaved-Caspase-12和 Cleaved-Caspase-3蛋白的表达与正常组相比显著升高。与模型组相比,逆转恢复2、4和8周组肝组织Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达降低,但仍高于正常组。结论 ERS标志性蛋白Caspase-12诱导的细胞凋亡存在于大鼠肝纤维化病程中,可能与肝纤维化的发生、发展和恢复逆转密切相关。     

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白（PGRP—L）的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术。从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP—L的PGRP结构域基因片段,将其克隆人pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果RT—PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T载体连接构建成重组质粒prnPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP—L分子PGRP结构域基因,为PGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

离体大鼠心肌内质网应激模型构建条件的优化

目的： 探讨构建体外心肌内质网应激endoplasmic reticulum stress (ERS)模型的方法及实验条件。方法：应用Langendorrf 灌流装置制作大鼠心脏离体缺血/再灌注模型,采用PowerLab系统持续监测血流动力学参数,western-blot检测缺血（停止灌流）不同时间/再灌注120min后心肌ERS标志性分子糖调节蛋白（GRP）78的表达,并检测C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测二者mRNA的表达;体外孵育心肌组织切片,分别应用不同浓度的衣霉素(tunicamycin, Tm)和二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)处理3h和6h,western-blot检测心肌GRP78及CHOP的表达。结果：与对照组相比,离体灌注心脏缺血40min /再灌注120min时,心肌GRP78表达最高（P <0.01）,CHOP蛋白、GRP78mRNA及CHOPmRNA表达均明显升高（P <0.01,P <0.05和P <0.05）同时,各项血流动力学参数受损（均P < 0.01）;Tm10μg/mL和DTT 2mmol/L孵育心肌组织切片3h时,GRP78表达较对照组显著升高（均P <0.001）,CHOP表达亦均明显升高（P <0.05和P <0.01）。结论：使用离体大鼠心脏缺血/再灌注和孵育心肌组织切片的方法,均可成功构建体外心肌ERS模型。     

内质网应激相关蛋白与CXCL12蛋白在特发性肺纤维化中的表达及意义

目的 探讨内质网应激相关蛋白及CXCL12在特发性肺纤维化中的表达及意义.方法 收集荆州市中心医院2004～2014年诊断为特发性肺纤维化且存有活检或手术标本的患者共18例,并收集正常肺组织20例作为对照,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激相关蛋白(GRP78、CHOP)及CXCL12蛋白(SDF-1)的表达,通过逆转录PCR(RT-PCR)检测肺组织中GRP78 mRNA及CXCL12 mRNA的表达.结果 与对照相比,肺纤维化患者肺泡上皮中GRP78、CHOP、CXCL12蛋白表达均上调,且GRP78 mRNA及CXCL12 mRNA也表达上调.结论 内质网应激相关蛋白及CXCL12在特发性肺纤维化的发病过程中起重要作用,可能参与了特发性肺纤维化的发生与发展.     

滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研究

目的:运用中药血清药理学方法研究滋补脾阴方药含药血清对内质网应激的保护作用并探讨其机制。方法:以N-糖链抑制剂衣霉素(tunicamycin,Tm)刺激小鼠神经瘤母细胞Neuro2a建立内质网应激模型,滋补脾阴方药含药血清为干预组,采用逆转录聚合酶链式反应方法观察葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)和凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/EBP homologousprotein,CHOP)的mRNA表达;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验观察Tm、星形孢菌素(staurosporine,STS)刺激Neuro2a细胞后的LDH泄漏率。结果:各浓度滋补脾阴方药含药血清预处理组GRP78及CHOP mRNA表达与Tm(5μg/ml)组相比,表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),因此滋补脾阴方药含药血清可以抑制Tm诱导内质网应激时GRP78及CHOP mRNA的表达。各浓度滋补脾阴方药含药血清预处理组与Tm组相比,LDH泄漏率明显下降(P<0.05),因此滋补脾阴方药含药血清可以降低Tm和STS刺激后的LDH泄漏率。结论:滋补脾阴方药具有神经保护作用,其机制可能是通过抑制内质网应激及线粒体损伤。     

内质网应激(ERS)在缺血性心脏病(IHD)中的作用机制

 内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的发生和治疗有着密切的关系。进入21世纪之后,ERS作为IHD的重要机制受到各国学者的广泛关注。本文着重阐述以下三方面的研究进展：ERS激活的信号通路、内质网应激反应(ERS response,ERSR)范围内ERS对细胞保护作用的信号通路及超出ERSR范围后ERS对细胞损伤作用的信号通路,并在此基础上经过分析提出4条治疗IHD的思路。     

大鼠脑皮质内质网应激及凋亡相关因子在控制性低血压中的变化

目的探讨在不同程度控制性低血压中大鼠脑皮质神经元内质网应激（ERS）及凋亡的变化。方法24只SD雄性大鼠随机
均分为A组（对照组）、B组（70 mmHg）、C组（50 mmHg）、D组（30 mmHg)四组。大鼠麻醉后用硝普钠复合艾司络尔诱导控制性
低血压,达到目的血压后维持60 min。对照组无降压,各组大鼠最终补液量相等。控制性低血压完成后12 h断头取脑,western
blot法检测脑皮质中Bax、Bcl-2、GRP78、CHOP、caspase-12表达,RT-PCR法检测脑皮质GRP78 mRNA表达,TUNEL法检测皮
质神经元凋亡。结果与A组比较,C组及D组中ERS相关因子GRP78 mRNA,GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表达明显增加且
组间有统计学差异（P<0.05）,在B组未见明显变化（P>0.05）;与A组比较,C组及D组中凋亡细胞数明显增加,Bax表达上调,
Bcl-2表达下调（P<0.05）,在B组未见明显变化（P>0.05）。结论轻度的控制性低血压（70 mmHg）不会引起脑皮质神经元损伤,
而程度较重的控制性低血压（低于50 mmHg）可以诱导脑皮质神经元ERS及凋亡。
     

Effects of lead exposure on placental cellular apoptosis and endoplasmic reticulum stress in rats

Background Lead exposure during pregnancy contributes to fetal abortion and/or teratogenesis.Endoplasmic reticulum （ER） apoptosis can be induced by various pathological conditions when ER function is disturbed.However,it is unclear whether ER stress and apoptosis play a role in the etiology of lead-exposed disease status.We aimed to investigate whether lead induced placental apoptosis and subsequent toxicity is initiated by ER apoptosis via caspase-12.Methods Sixty-three female Wistar rats were exposed to lead in drinking water during various gestational periods.Blood lead level was determined by atomic absorption spectrophotometry.Placental cytoplasmic organelles were examined by electronic microscopy.Placental caspase-12 mRNA expression was evaluated by qRT-PCR.TUNEL assay was used to determine the placental apoptosis.Results Lead exposure significant induced ER apoptosis compared to that of the controls （P ＜0.05）,accompanied with increased caspase-12 mRNA expression.Significant differences of caspase-12 mRNA expression levels were observed among the four groups （F=13.78,P ＜0.05）.Apoptotic index （AI） was significantly increased in experimental groups compared to that of the controls （F=96.15,P ＜0.05）.In lead-exposed groups,trophoblast cells underwent degeneration and fibrin deposition; Mitochondria were swollen and decreased in number; ER swelling,expansion,and vacuolization were observed.Conclusion Lead exposure contributes to placental apoptosis,as well as increased caspase-12 mRNA expression,which in turn promoted ER stress.     

嗜热菌热休克蛋白基因的克隆与表达

克隆和在原核表达系统中表达超嗜热古球菌之热休克蛋白基因β亚基。方法：用ＰＣＲ技术从ＨＰＫ基因组ＤＮＡ中扩增ｃｐｋＢ基因片段，经克隆和核苷酸序列分析后再克隆至原核表达载体ｐＢＶ２２０，升温诱导ｃｐｋＢ基因表达，利用ＣｐｋＢ蛋白的耐温特性纯化该蛋白。结果：扩增和克隆了１．６ｋｂ的ｃｐｋＢ基因，并经ＤＮＡ测序证实，实现了ｃｐｋＢ基因在原核系统ＰＬＰＲ启动子控制下的表达，建立了纯化ＣｐｋＢ蛋白的方法。结论     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2C端基因的克隆与鉴定

目的:获得人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2(MASP-2)C端编码基因,并表达人MASP-2 C端片段,为制备单克隆抗体及应用于临床相关疾病的检测奠定分子学基础.方法:采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2 C端的cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,酶切图谱分析和序列分析鉴定.结果...     

内质网应激相关因子PERK和ATF6在结肠癌中的表达及意义

目的 探讨内质网应激相关因子蛋白激酶R样内质网调节激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)在结直肠癌组织中的表达情况,分析PERK和ATF6在结肠癌发生发展中的作用.方法 选择手术切除结肠癌组织及距离病变组织5 cm以上正常组织,采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测PERK和ATF6的mRNA表达情况,免疫组织化学法(IHC)、Western blot法检测PERK和ATF6蛋白的表达情况,并结合临床病理特征,分析其与结肠癌发生、发展之间的关系.结果 肿瘤组织ATF6和PERK mRNA表达均较正常组织下调(P＜0.05).IHC和Western blot结果显示PERK和ATF6在结肠癌中的表达均显著低于正常组织(P＜0.05).PERK和ATF6主要定位于上皮细胞中.结论 PERK和ATF6在结肠癌中的表达水平下降说明缺乏适当的内质网应激反应可能在肿瘤的发生机制中起作用.