兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞的途径.方法 抽取兔骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代.取第3代细胞诱导培养,倒置显微镜下观察细胞形态.培养16 d后,用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)底物显色试剂检测碱性磷酸酶(AP),茜素红染色检测钙结节.结果 全骨髓贴壁培养法可获得MSCs,原代和传代培养的MSCs具有活跃的增殖能力.诱导培养后,AP检测与钙结节染色均为强阳性.结论 兔骨髓中培养出的MSCs可以定向分化为成骨细胞,可用作骨组织工程中的种子细胞.     

巴戟天对成骨细胞生物学特性影响的实验研究

目的：观察巴戟天对体外培养成骨细胞(OB)增殖及其活性的影响，探讨巴戟天补肾壮骨作用的实质。方法：取新生SD大鼠头盖骨提取成骨细胞，进行生长曲线分析，测定巴戟天对细胞增殖及分泌ALP、BGP、TGF-β1的影响。结果：巴戟天能显著刺激OB增殖；巴戟天与密钙息均可促进分化中的OB分泌ALP和骨钙素，促进OB表达TGF-β1。结论：巴戟天具有与密钙息相同的作用，即促进OB分泌ALP和骨钙素，促进OB表达TGF-β1mRNA，从而大量分泌Ⅰ型胶原，以利钙盐沉积。     

Al2O3微粒对成人成骨细胞的影响

目的 研究特定粒径与浓度的氧化铝(aluminium oxide,Al2O3)陶瓷磨损微粒对成人成骨细胞的增殖、分化、成骨能力及相关细胞因子表达的影响.方法 取成人成骨细胞原代培养,扩增,并行表型鉴定.将Al2O3陶瓷微粒按粒径不同分为3组,每组制成3种不同浓度的混悬液,消除内毒素后,加入成骨细胞培养体系,37℃,5%CO2条件下孵育.分别四氮唑盐(MTT)比色法,碱性磷酸酶(ALP)活性测定,茜素红染色钙结节计数以及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨细胞的增殖、分化、成骨能力及RANKL、OPG、OCN基因表达的差异.结果 中等粒径(1～10 μm)中浓度组(微粒∶细胞=100∶1)的Al2O3陶瓷微粒在增殖分化及OPG、OCN基因表达方面的活性低于空白对照组(P＜0.01).结论 Al2O3陶瓷磨损微粒可直接作用于成骨细胞,抑制成人成骨细胞的增殖与ALP活性,其细胞反应与微粒的粒径与浓度存在关联.     

咯利普兰在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用

目的 研究咯利普兰在体外骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中的作用.方法 体外分离培养小鼠股骨骨髓间充质干细胞,随机分为咯利普兰10 μmol/L组(A组)和对照组(B组).骨髓间充质干细胞向成骨诱导分化后,检测碱性磷酸酶(ALP)活性;Western blot检测Runx2和骨钙素表达;茜素红染色观察钙结节形成情况.结果 与B组相比,A组ALP活性及Runx2、骨钙素表达均增加(P＜0.01或P＜0.05),钙结节形成更加明显.结论 咯利普兰能提高体外骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力.     

体外诱导人牙龈成纤维细胞多向分化潜能的实验研究

目的 探索人牙龈成纤维细胞（hGFs）是否具有多向分化潜能, 为组织工程学提供新的细胞来源。方法 经志愿者知情同意后收集健康牙龈组织, 组织块法培养 hGFs。取第 3 代 hGFs 进行成骨、 成软骨和成脂诱导, 未分化诱导的细胞为对照组。分别用碱性磷酸酶 （ALP） 染色和茜素红染色、 阿利新蓝染色、 油红 O 染色检测细胞成骨、 成软骨和成脂能力。实时定量聚合酶链反应 （PCR） 检测细胞中成骨分化标志基因 ALP、 runt 相关转录因子 2 （Runx2）、成软骨分化标志基因聚集蛋白聚糖（AGR）和成脂分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）的表达。结果 成骨诱导组培养至 7 d 时 ALP 染色可见大量的蓝紫色沉淀, 28 d 时细胞周围有大量红染的钙结节沉积,而对照组无钙结节, 培养至 14 d 细胞中 ALP 和 Runx2 表达明显高于对照组（P < 0.01）。14 d 时成软骨诱导组阿利新蓝阳性, 成脂诱导组可见红色的脂肪滴, 而对照组 2 种染色为阴性, AGR、 PPARγ2 表达均明显高于对照组（P <0.01）。结论 hGFs 具有成骨、 成软骨和成脂分化的多向分化潜能。     

马氏珠母贝糖胺聚糖对体外成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响

目的观察珠母贝糖胺聚糖在体外对新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响。方法应用MTT法、PNPP法、茜素红染色 (ARS)矿化骨结节及用图像分析仪计算骨结节的面积等方法观察细胞的增殖、碱性磷酸酶 (ALP)活性及矿化结节形成的影响。结果珠母贝糖胺聚糖 0 .0 0 8～ 0 .5 g·L- 1在不同时间MTT测得的A值均低于空白对照组 ,不促进细胞的增殖 ;各浓度组在培养 5d时 ,碱性磷酸酶的活性显著高于空白对照组 ;培养 31d后茜素红染色显示 ,0 .0 6 3g·L- 1组所形成的骨结节面积显著大于空白对照组。结论珠母贝糖胺聚糖对体外培养的SD新生大鼠颅骨成骨细胞有显著促进分化和矿化的作用 ,但不促进细胞的增殖。     

非病毒载体携带Cbfa1诱导成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:观察核心结合因子a1(Cbfa1)对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向成骨细胞定向分化的诱导作用。方法:经密度梯度离心法和贴壁筛选法获得hBMSCs。非病毒载体FuGene HD携带Cbfa1转染hBMSCs后7、14d,经Real-time PCR分析hBMSCs成骨细胞标志基因表达,包括Cbfa1、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原;培养1、2和3周,ALP染色、钙结节染色检测成骨分化。结果:培养的hBMSCs阳性表达CD73,阴性表达CD34。第3代细胞增殖曲线呈"S"形,符合对数生长曲线。Cbfa1转染hBMSCs表现出与成骨细胞相似的形态,成骨细胞标志基因ALP、OC、OPN和Ⅰ型胶原的表达均明显上调,ALP染色阳性,并且有明显的钙结节形成。结论:非病毒载体携带Cbfa1转染hBMSCs可诱导其向成骨细胞分化。     

胎兔颅骨成骨细胞克隆筛选及鉴定

目的：筛选胎兔颅骨细胞原代培养中的细胞克隆,建立成骨细胞株。方法：从服兔颅骨组织中分离培养颅骨细胞,在此基础上,运用有限稀释法进行克隆传代筛选,建立成骨细胞株,并运用酶组化、免疫级化及染色体染色等方法予以鉴定。结果：原代培养的颅骨细胞来源复杂,形态多样;克隆传代筛选的细胞株,细胞形态单一,碱性磷酸酶组化染色呈强阳性,骨形态发生蛋白免疫级化染色呈强阳性,钙红染色显示具有成骨能力;染色体数目形态保持相对稳定。结论：利用有限稀释和克隆传代培养筛选建立的成骨细胞株,生物学性状均一,遗传学性状稳定。     

纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架材料复合大鼠成骨细胞培养的实验研究

目的 将纳米羟磷灰石/壳聚糖(nHA/CS)支架材料与大鼠的成骨细胞在体外复合培养,研究其生物相容性,以期在骨组织工程支架材料的选择方面提供依据.方法 原代培养大鼠成骨细胞,倒置显微镜作细胞形态学观察,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红钙染色对细胞进行鉴定.将第三代细胞与nHA/CS材料体外复合培养,采用MTT比色法和...     

苔黑酚葡萄糖苷通过抑制糖皮质激素受体入核保护地塞米松诱导成骨细胞损伤作用北大核心CSCD

目的 考察苔黑酚葡萄糖苷对地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导成骨细胞损伤的保护作用,并探讨其调控机制。方法 从新生小鼠颅盖骨提取并培养原代成骨细胞(osteoblast,OB),用DEX(1μmol·L^(-1))诱导成骨细胞损伤为模型。采用CCK-8法测定不同浓度苔黑酚葡萄糖苷及有无DEX干预下对成骨细胞增殖的影响;采用试剂盒进行成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性测定;采用茜素红S染色观察骨矿化结节的形成;采用Annexin V-FITC法检测细胞凋亡情况;采用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察细胞内糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的入核情况;采用Western blot法检测GR在细胞核、细胞质和全细胞中的蛋白表达,以及细胞中成骨特征蛋白CollagenⅠ、Runx2、Osterix(Osx)和Dlx5的表达。结果 与对照组相比,DEX组成骨细胞增殖、分化和矿化均明显降低(P<0.05、0.01),细胞凋亡明显升高(P<0.01);与模型组相比,苔黑酚葡萄糖苷组成骨细胞增殖、分化和矿化均明显升高(P<0.01),细胞凋亡明显降低(P<0.05)。与对照组相比,DEX组成骨细胞中GR在核内的表达明显升高(P<0.01),而GR在全细胞和细胞质中的表达明显降低(P<0.01),同时成骨特征蛋白表达也明显降低(P<0.01);与模型组相比,苔黑酚葡萄糖苷组GR在成骨细胞核内的表达明显降低(P<0.01),而GR在全细胞和细胞质中的表达明显升高(P<0.01),成骨特征蛋白的表达均明显升高(P<0.01),且呈剂量依赖关系。结论 苔黑酚葡萄糖苷能够改善DEX诱导的成骨细胞增殖、分化和矿化的抑制作用,并减少其凋亡,其作用机制与苔黑酚葡萄糖苷抑制GR入核,从而调控成骨相关蛋白表达有关。     

胰高血糖素样肽-1及其类似物EX-4促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化

目的:观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其受体激动剂exendin-4(EX-4)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:取大鼠股骨和胫骨全骨髓,采用贴壁法分离BMSCs并传代至第三代,培养2d后分成4组:BMSC组、诱导成骨组(osteoblast induced medium,OIM组)和诱导加药组,诱导加药组细分为GLP-1(10-9~10-7 mol/L)或EX-4(10-9~10-7 mol/L)的不同浓度组,MTT法检测细胞增殖能力;测定碱性磷酸酶(ALP)活性;通过ALP染色及茜素红染色观察药物诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果;采用RT-PCR方法检测ALP和Runx2成骨相关基因的表达情况。结果:与诱导对照组相比,GLP-1及EX-4各浓度处理组呈剂量依赖性显著促进细胞增殖(P<0.05);ALP染色与茜素红染色结果显示,对照组无显色或显色不明显,而GLP-1及EX-4组均有阳性显色。GLP-1及EX-4可以显著提高ALP活性,并提高Runx2、ALP的表达水平。结论:GLP-1及EX-4不仅能够直接促进BMSCs增殖,并促进其向成骨细胞分化,GLP-1及EX-4可能在骨重建中发挥重要的作用。     

龙牙楤木皂苷Ⅳ对原代成骨细胞分化和矿化的影响

目的 研究龙牙楤木皂苷Ⅳ（Tarasaponin Ⅳ）对原代成骨细胞的分化及矿化的影响。方法 通过消化SD乳鼠颅盖骨,获得原代前成骨细胞,体外诱导培养并鉴定;采用MTT比色法检测Tarasaponin Ⅳ（10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL）作用于前成骨细胞的适宜质量浓度范围;用低、中、高浓度（0.5、5、50 μg/mL） Tarasaponin Ⅳ对成骨细胞进行干预,培养4 d后,试剂盒法进行细胞上清中碱性磷酸酶（ALP）活性测定;培养14 d后,按茜素红S染色试剂说明对细胞进行钙化结节染色。结果 与对照组比较,Tarasaponin Ⅳ各浓度组均能明显提高前成骨细胞活性（P<0.05、0.01）,0~60 μg/mL内细胞生存率呈递增趋势。与对照组比较,Tarasaponin Ⅳ低、中、高浓度组细胞上清ALP活性均显著下降（P<0.01）,中、高浓度组细胞矿化结节数目显著增多（P<0.01）,且均呈剂量相关性。结论 Tarasaponin Ⅳ可以促进前成骨细胞生长,增强成骨细胞矿化过程。     

肉桂酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响

目的研究中药有效成分肉桂酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响。方法肉桂酸处理MG-63细胞前后,台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞仪检测细胞周期时相变化;光镜和电镜观察细胞形态和超微结构;VanGieson染色检测细胞Ⅰ型胶原表达;茜素红染色观察钙化骨结节形成;免疫细胞化学检测骨粘素和骨钙蛋白表达。结果肉桂酸明显抑制MG-63细胞增殖,D7抑制率达54.94%±4.69%。周期分析结果显示,肉桂酸处理后G0/G1期细胞比例较对照组明显升高(P<0.01)。光镜和电镜结果显示,肉桂酸处理组MG-63细胞形态和超微结构发生明显改变,呈现相应正常细胞的形态和超微结构特征。肉桂酸促进成骨细胞分化标志物Ⅰ型胶原、骨粘素和骨钙蛋白的表达与钙沉积以及典型骨结节的形成。结论肉桂酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖并诱导其向成骨细胞分化。     

橘红素预处理对过氧化氢诱导成骨细胞损伤的保护作用及机制

目的 研究橘红素预处理对过氧化氢(H₂O₂)诱导的成骨细胞氧化损伤的保护作用和机制。方法(1)酶消化法分离培养大鼠颅骨来源的原代成骨细胞,分别培养7和21 d后,采用碱性磷酸酶(AKP)染色和茜素红染色鉴定细胞。(2)橘红素5～40μmol·L^-1孵育成骨细胞48 h后,加H2O2300μmol·L^-11 h,采用CCK-8法测定细胞存活率,AKP试剂盒测定AKP活性。(3)培养的成骨细胞分为细胞对照组、模型组(H2O2300μmol·L^-1,孵育1 h)、模型+橘红素组(橘红素10μmol·L^-1预处理48 h后加H2O2300μmol·L^-1,1 h)。茜素红染色检测钙化结节数量,流式细胞术检测成骨细胞内活性氧(ROS)水平,超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒检测SOD活性,Western印迹法检测成骨细胞转录因子(OSX)和骨保护素(OPG)蛋白表达水平。结果 (1) AKP染色成骨细胞细胞胞质呈蓝色,茜素红染色可见钙化结节...     

巴戟天多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

目的通过观察巴戟天多糖对骨髓间充质干细胞骨髓间质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化的影响。方法利用髓贴壁法分离培养BMSCs,并通过形态学、流式细胞仪检测细胞表面标志物以鉴定所取得的细胞;采用细胞计数(CCK-8)法检测不同浓度巴戟天多糖对BMSCs增殖情况的影响;对硝基苯磷酸盐法(p NPP)检测不同浓度巴戟天多糖对BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,以确定其最佳促分化的剂量。后续实验分空白组、巴戟天多糖组、成骨诱导组,在培养第7,14,21天分别收集各组细胞上清液,检测其ALP活性;培养第21天采用茜素红染色法检测各组BMSCs矿化情况。结果随着培养时间的延长,巴戟天多糖高、中浓度组可显著提高BMSCs的增殖(P0.05),其中高浓度组效果最佳。与空白组相比,巴戟天多糖组可提高BMSCs上清液中ALP活性(P0.05),增加其矿化结节数(P0.05)。结论巴戟天多糖能促进BMSCs的增殖及向成骨细胞分化的能力。     

黄瓜籽多肽的抗骨质疏松作用

目的:研究黄瓜籽多肽的抗骨质疏松作用.方法:利用噻唑蓝(MTT)法、碱性磷酸酶(ALK)比活性测定、茜素红染色矿化骨结节,研究黄瓜籽多肽对原代培养的成骨细胞增殖、分化的影响;体内试验:对SD大鼠实施手术去除双侧卵巢,造成骨质疏松模型,口服3种(10.0,40.0,160.0 mg·kg-1 ·d-1)剂量黄瓜籽多肽,饲...     

骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离培养方法并鉴定其生物学特性.方法 采用全骨髓贴壁细胞培养法进行BMSCs的分离培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特性,绘制细胞生长曲线,并检测细胞在不同诱导条件下向成脂肪细胞和成骨细胞分化的能力.结果 原代大鼠BMSCs培养24 h后镜下观察大部分细胞已经贴壁,传至第三代,细胞形态均一,呈梭形、螺旋样排列.经过约2 d的适应期,3～7 d进入对数生长期,7 d后进入平台期;成骨细胞诱导18 d,茜素红染色可见明显钙结节,成脂肪细胞诱导2周后油红O染色可见明显脂质沉淀.结论 全骨髓贴壁细胞培养法操作简单、快速,可以获取形态均一、纯度较高的BMSCs.     

bFGF对骨髓基质细胞的增殖作用及其临床意义

目的 探讨成纤维细胞生长因子（bFGF)对骨髓前体细胞的增殖作用及其临床意义。方法 分离骨髓前体细胞体外培养，用碱性磷酶化学染色及图像分析测定细胞克隆数；采用免疫组化（ABC法）检测ALP，骨钙素及钙，研究bFGF对NASP的促增殖作用。结果 骨髓细胞中许多基质前体细胞以非贴壁细胞形式存在，bFGF不仅能促进NASP细胞增殖，而且能诱导NASP细胞向成骨细胞分化。结论 bFGF主要作用于非贴壁生长的基质前体细胞，bFGF能增加骨细胞的数量，促进骨样组织形成，为临床用bFGF治疗骨折，骨不连提供理论依据。     

电磁场不同处理时间对人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

目的研究频率50 Hz强度1.8 m T下的不同处理时间正弦交变电磁场对体外培养人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响。方法体外分离培养人脐带间充质干细胞,传代后随机分为6组,每天于倒置相差显微镜下观察细胞形态;MTT测定细胞增殖;10 d、12 d、14 d和16 d测定ALP活性;15 d行茜素红钙化结节染色以及17 d行vonkossa染色;第13 d ALP组织化学染色;在磁场处理后的4 d和6 d行Real-time RT-PCR检测Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)和骨形态发生蛋白(BMP-2)mRNA表达量的变化。结果 0.5 h组可促进细胞增殖;磁场处理10 d~12 d后细胞出现钙化趋势;2.5 h组在SEMFs处理16 d和18 d后ALP活性均高于对照组(P<0.05);1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组钙化结节茜素红染色面积均高于对照组(P<0.01,P<0.05);1.5 h组Collagen-ⅠmRNA表达水平高于对照组(P<0.05),2.0 h和2.5 h组ALP组织化学染色面积、Collagen-Ⅰ、BMP-2 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论 50 Hz 1.8 m T的正弦交变磁场能促进体外培养人脐带间充质干细胞成骨性分化,尤以处理2.5 h促进人脐带间充质干细胞成骨性分化最为明显。     

bFGF对骨髓基质细胞的增殖作用及其临床意义

目的探讨成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓前体细胞的增殖作用及其临床意义。方法分离骨髓前体细胞体外培养,用碱性磷酸酶化学染色及图像分析测定细胞克隆数;采用免疫组化(ABC法)检测ALP、骨钙素及钙,研究bFGF对NASP的促增殖作用。结果骨髓细胞中许多基质前体细胞以非贴壁细胞形式存在,bFGF不仅能促进NASP细胞增殖,而且能诱导NASP细胞向成骨细胞分化。结论bFGF主要作用于非贴壁生长的基质前体细胞,bFGF能增加骨细胞的数量,促进骨样组织形成,为临床用bFGF治疗骨折、骨不连提供理论依据。