PCNA反义寡核苷酸抑制大鼠胶质瘤生长的实验研究

目的探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对大鼠胶质瘤生长的抑制作用。方法所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区接种1．0×10^6胶质瘤细胞。治疗组接种C6胶质瘤细胞后24h内用PCNA反义寡核苷酸原位穿刺注射进行治疗，对照组只注射Hank’s液，每周1次，连续4周；观察两组大鼠肿瘤的一般情况与生存期。4周后断颈处死大鼠，完整地取下肿瘤，测量肿瘤体积，计算其抑瘤率。结果PCNA—ASODN治疗组大鼠胶质瘤的生长明显受到抑制，抑瘤率为64．5％。结论PCNA反义寡核苷酸对胶质瘤的生长具有抑制作用，通过反义技术可抑制靶基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞的增殖。     

反义c-myc、增殖细胞核抗原基因片断抑制血管平滑肌细胞相关基因表达

目的研究有效的防治血管术后再狭窄的方法，以及应用反义ｃｍｙｃ、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因片断来封闭其相应基因表达的可行性。方法设计并合成ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ正义、反义及四个碱基错配的反义寡核苷酸，经体外稳定性检测和细胞转染实验证实其有效性后，分别作用于体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），应用逆转录ＰＣＲ半定量测定及计算机图像分析的方法，观测其对ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ基因表达的影响。结果设计合成的寡核苷酸在血清培养基中１～５天未被完全降解；寡核苷酸能顺利进入ＶＳＭＣｓ内；１０μｍｏｌ／Ｌ浓度的反义ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ作用于ＶＳＭＣｓ后１～５天，其相应的ｃｍｙｃ和ＰＣＮＡ基因表达减弱，计算机图像分析表明其表达产物与对照组相比差异有显著意义（Ｐ＜０．０５），而正义和错配反义寡核苷酸无此效应（Ｐ＞０．０５）。结论反义ｃｍｙｃ和ＰＣＮＡ寡核苷酸可通过抑制其相应基因表达来实现阻遏血管平滑肌细胞增殖     

可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸预防静脉移植物再狭窄

目的 :研究可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸是否具有抑制静脉移植物内膜增殖的效果。方法 :2 5只健康纯种新西兰大耳白兔按体重随机分对照组 ,支架组 ,正义组 ,反义组 ,错配组 ,将颈外静脉间置于同侧颈总动脉后用可溶性支架将反义 ,正义及错配的基因片段导入静脉移植物。术后 2 8d检测各组内膜、中膜的厚度。结果 :①反义组静脉桥的内膜厚度为 42 .72± 3 .792 μm ,显著低于对照组、支架组、正义组及错配组 ( 79.0 0± 1.2 2 5μm ,75.0 4± 3 .2 42 μm ,74.77± 8.53 5μm ,78.61± 7.816μm ,P <0 .0 1)。②反义组内膜与中膜比值为 0 .68± 8.70 1,明显低于对照组、支架组、正义组及错配组 ( 1.3 2± 0 .0 66,1.3 5± 0 .198,1.3 3± 0 .2 58,1.3 9± 0 .2 0 0 ,P <0 .0 1)。结论 :反义PCNA基因可明显抑制内膜的增殖 ,有预防移植血管再狭窄的作用     

大鼠胶质瘤动物模型建立及肿瘤PCNA表达的观察

目的建立稳定的大鼠颅内胶质瘤动物模型及观察增殖细胞核抗原(PCNA)在肿瘤中的表达。方法在体外培养C6细胞,借用立体定向仪将C6细胞接种于大鼠右侧尾状核区,观察大鼠生存状态,分别在接种后9、15及21天处死,解剖各组荷瘤大鼠,进行组织病理学检查并检测不同时期胶质瘤PCNA的表达。结果此模型胶质瘤生长特性及组织学特征与人类极为相似,不同时期胶质瘤中PCNA均呈高表达,接种后9天组尤其明显。结论该方法建立的胶质瘤模型成瘤率高、重复性好,PCNA在各期均高表达说明胶质瘤增殖活跃。     

PCNA的反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌HeLa细胞的研究

目的　检测脂质体介导增殖细胞核抗原 (PCNA)反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性效果。方法　应用细胞生长曲线和MTT比色法检测细胞增殖活性 ,并采用免疫组织化学方法 (SABC法 )检测PCNA蛋白的表达。结果　反义寡聚核苷酸处理组细胞与对照组比较生长曲线差异有显著性 ,增殖显著受抑 (P <0 0 5 ) ,PCNA蛋白表达完全抑制。而正义寡聚核苷酸组则无此作用 (P >0 0 5 )。结论　提示PCNA反义寡聚核苷酸可以显著抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性 ,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现     

脑胶质瘤survivin表达及其反义核酸对U251细胞的作用

目的:观察脑胶质瘤患者脑组织生存素(survivin)的表达及其反义寡核苷酸(survivin ASODN)对脑胶质瘤U251细胞生长和凋亡的影响。方法:RT-PCR法检测脑胶质瘤患者脑组织survivin mRNA表达,脂质体介导下,分别以100、300、500 nmol/Lsurvivin ASODN作用于脑胶质瘤U251细胞48 h后,观察细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:脑胶质瘤患者脑组织有survivin mRNA表达,阳性率为76.7%。不同浓度survivin ASODN转染48 h后,细胞生长抑制率分别为(52.24±6.59)%、(36.14±4.01)%和(24.14±5.57)%,凋亡指数分别为(19.46±3.85)%、(38.6±1.85)%和(55.34±3.16)%,与对照组及不同浓度组间比较差异有统计学意义(P<0.05~P<0.01)。结论:脑胶质瘤患者脑组织有survivin mRNA表达,survivin ASODN以剂量依赖方式抑制脑胶质瘤U251细胞生长,诱导细胞凋亡。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制大鼠脑胶质瘤生长

目的:观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡核苷酸对脑胶质瘤的抑制作用.方法:所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区注射含C6胶质瘤细胞1×106的Hank液20 μl,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种1、2周后分别原位注射1 mmol/L和2 mmol/L的VEGF反义寡核苷酸,对照组则在接种1、2周后原位注射20 μl的Hank液.接种2、3周后给大鼠作磁共振检查,第3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,标本常规H-E染色.结果:实验组大鼠有较好的生存状态,而对照组在接种后第2周时开始出现颅内高压,至第3周时大多数大鼠处于濒危状态.实验Ⅰ组、Ⅱ组的抑瘤率分别为 91.5％和100％ .结论:原位注射含VEGF反义寡核苷酸能抑制荷瘤大鼠脑胶质瘤生长.     

垂体瘤转化基因反义寡核苷酸抑制胶质瘤增殖的实验研究

目的 观察垂体瘤转化基因(pituitary tumortr ansforming gene,PTTG)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对恶性胶质瘤增殖的抑制作用.方法 将C6胶质瘤细胞接种于大鼠右侧尾状核.按照不同的PTTG反义寡核苷酸浓度在选定的时间点立体定向原位注射于肿瘤区域.3周后处死大鼠,取标本做GFAP、PTTG、PCNA免疫组化染色.结果 不同浓度的PTTG-ASODN对C6胶质瘤模型的增殖抑制呈时间、浓度依赖性,而且高浓度,早期应用,反复应用PTTG-ASODN抑制胶质瘤模型肿瘤增殖的效果明显.结论 PTTG-ASODN可以抑制胶质瘤的增殖,有望成为胶质瘤基因治疗的一种新策略.     

反义c—myc,增殖细胞核抗原基因片断抑制血管平滑细胞相关基因表达

目的 研究有效的防治血管术后狭窄的方法,以及应用反义ｃ－ｍｙｃ,增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因片断来封闭其相应基因表达的可行性。方法 设计并合成ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ正义,反义及四个碱基错配的反义寡核苷酸,经体外稳定性检测和细胞转染实验证实其有效性后,分别作用于体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）,应用逆转录ＰＣＲ半定量测定及计算机图像分析的方法,春对ｃ－ｍｙｃ、ＰＣＮＡ基因表达的影响。结果 设计     

丹皮酚抑制U251人脑胶质瘤细胞增殖的作用研究

目的 探讨丹皮酚(Paeonol,Pae)对人脑胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响.方法 采用MTT法检测丹皮酚对体外培养的人脑胶质瘤细胞株U251的增殖抑制作用,用透射电镜和流式细胞仪观察Pae对U251细胞的诱导凋亡作用.结果 Pae在31.25～250 mg/L浓度范围内对U251细胞的增殖均有抑制作用,呈现明显的量效和时效依赖关系.诱导电镜下可见肿瘤细胞发生凋亡改变.Pae在31.25～250 mg/L浓度下均可诱导U251细胞发生凋亡,其浓度越高、作用时间越长,凋亡率越高,有明显的时效和量效关系.结论 Pae对有抑制人脑胶质瘤细胞株U251的增殖和诱导其发生凋亡的作用.     

韧粘素反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨韧粘素 (TN)反义寡核苷酸 (ODN)对培养大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的抑制作用。方法采用细胞计数及快速竞争性逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)等方法 ,观察不同剂量 ( 5、10、2 0 μg/ml)TN反义ODN和正义ODN对体外培养大鼠VSMC的增殖以及TNmRNA表达水平的影响。　结果TN反义ODN可有效抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖 ,作用呈剂量依赖性 (反义组 5、10、2 0 μg/ml剂量细胞计数分别为 10 5/ml× ( 4 .99± 0 .2 1)、( 4 .0 8± 0 .14 )、( 2 .85± 0 .39) ,对照组为 10 5/ml× ( 5 .95± 0 .41) ,(P <0 .0 5 ) ;TN反义ODN亦可下调TNmRNA表达水平 (反义组 0 .32± 0 .0 5 ,对照组为 0 .5 2± 0 .0 8;P <0 .0 1) ;而TN正义ODN则无上述作用。　结论TN反义ODN可能通过下调TNmRNA表达水平而抑制血管平滑肌细胞的增殖。     

增殖细胞核抗原反义核酸对人肝癌细胞增殖的抑制作用

目的 观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）反义核酸对人肝癌细胞的抑增殖效应。方法 设计针对ＰＣＮＡｍＲＮＡ的１８个碱基的反义核酸,分反义组、正义组和空白组作用于ＨｅｐＧ－２肝癌细胞,ＭＴＴ法和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法观测肝癌细胞的生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果 反义组肝癌细胞生长受到明显抑制,抑制作用于培养４８ｈ达高峰,达５０％左右,７２ｈ后减弱,９６ｈ已基本消失。反义组肝癌细胞与空白对照     

反义技术封闭增殖细胞核抗原对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

为探讨用反义技术治疗骨肉瘤的可能性，将针对增殖细胞核抗原(PCNA）mRNA的不同剂量的反义寡核苷酸（ASODN）导入人骨肉瘤Saos-2细胞株，用^3H-TdR掺入法，免疫组化及双层软琼脂培养法检测其对肿瘤细胞增殖。PCNA表达及成瘤能力的影响。结果表明，ASODN能显著抑制Saos-2细胞增殖及PCNA表达，抑制作用呈剂量依赖性，30μmol/L浓度即可完全抑制PCNA表达，软琼脂培养无集落形成。表明通过反义技术抑制PCNA基因表达可对骨肉瘤细胞恶性表型产生逆转作用，开辟了骨肉瘤基因治疗的新途径。     

99mTc标记的寡核苷酸在人卵巢癌细胞中的摄取及其对目的基因表达的影响

目的研究针对增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA的反义寡核苷酸的标记方法,标记后探针在卵巢癌细胞株HO8910中的摄取情况及其对细胞增殖和目的基因表达的影响。方法人工合成一段针对PCNAmRNA的反义寡核苷酸(ASON),以放射性核素99mTc进行标记,研究标记物的标记率,放射化学纯度,与互补正义链寡核苷酸(SON)的结合能力,不同温度条件下在卵巢癌细胞中的摄取情况,以及反义探针对细胞增殖和细胞PCNAmRNA表达的影响。结果在双功能螯和剂NHSMAG3的作用下,ASON的标记率为(60.12±3.01)%(n=5),经纯化后放射化学纯度可达95%以上;标记物在体外能稳定存在,且仍保持与互补链的结合能力;37℃和22℃条件下,细胞对ASON的摄取率高于对SON,对ASON的清除速度缓于对SON,而37℃时,细胞对ASON的摄取明显高于22℃时,清除速度则明显快于22℃。标记的ASON与细胞孵育48h后,HO8910细胞中PCNAmRNA的表达显著减少。结论在双功能螯和剂的作用下,寡核苷酸能成功地得到标记,与SON相比,反义探针能被代谢旺盛的HO8910细胞特异性摄取并抑制目的基因的表达。     

反义寡脱氧核苷酸及卵泡刺激素对卵巢黏液性囊腺癌细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察卵泡刺激素受体（FSHR）反义寡脱氧核苷酸（antisense ODN）及卵泡刺激素（FSH）对体外培养人卵巢黏液性囊腺癌（OMC）细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法 OMC细胞与不同浓度的FSH、antisense ODN和无义ODN（onnsensc ODN）共培育48、72h后．采用免疫细胞化学SP法检测细胞核内PCNA的表达。结果FSH明显增强PCNA的表达，而antiscnse ODN则显著降低PCNA的表达．与对照组比较．差异均有显著性意义（均P＜0．05或P＜0．01）；应用nonsensc,ODN未观察到其对PCNA表达的影响。同时．antisense ODN可明显拮抗FSH促PCNA表达增加的作用，差异有极显著性意义（P＜0．01）。结论 在OMC发展过程中，FSH具有一定的促进作用．antisense ODN可有效抑制癌细胞的增殖以及FSH的促增殖作用。     

增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸调节脐血CD34+造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应

目的:探讨低浓度增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸(PCNA-ASODN)调节脐血造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应。方法:用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离出CD34 细胞,先后加入低浓度PCNA-ASODN作用于体外培养的CD34 细胞,用流式细胞仪检测培养后各种细胞的数量及细胞周期的变化。结果:实验组脐血CD34 造血前体细胞明显被扩增,但以第72 h组的扩增效应最为显著,其CD34 细胞比例增高[(35.6±1.8)%],而CD34 CD38-细胞数量扩增达(55.1±4.2)倍,且G0/G1期细胞占(49.8±2.5)%。结论:低浓度PCNA-ASODN对脐血CD34 造血前体细胞体外扩增的调节具有时间效应,同时能延缓扩增过程中伴随的细胞分化。     

端粒酶反义基因对恶性胶质瘤细胞生长的作用

目的研究端粒酶RNA的反义寡核苷酸(AODN)抗恶性胶质瘤细胞系的作用。方法采用脂质体包裹AODN转染恶性胶质瘤细胞系U251-MG细胞。用四唑盐MTT法测定细胞生长曲线,用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测细胞的端粒酶活性变化;用流式细胞术检测凋亡细胞。结果2~8μmol/L AODN转染恶性胶质瘤细胞系,培养1~4 d,恶性胶质瘤细胞系端粒酶活性下降,且有剂量依赖性和时间依赖性。AODN转染的恶性胶质瘤细胞培养后细胞增生速度减慢,发生了细胞凋亡。而无义寡核苷酸则无此效应。结论AODN能特异性抑制恶性胶质瘤细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡。     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU-87PCNA mRNA的表达水平.结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU-87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组.结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现.     

海洛因对C6细胞增殖细胞核抗原基因表达的影响

目的：检测海洛因对大鼠神经胶质瘤C6细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）基因表达的影 响,为探索海洛因成瘾的分子生物学机制提供依据。方法：大鼠神经胶质瘤C6细胞加入浓度为0～100 mg•L^-1的海洛因进行细胞培养,24 h后用MTT法检测海洛因对C6细胞存活率的影响。RT-PCR法检测海洛因作用下C6细胞PCNA mRNA的表达。结果：MTT结果显示海洛因浓度为10、20和100 mg•L^-1时C6细胞存活率分别为90.62%、80.97% 和62.73%,与对照组比较明显下降 (P<0.05)。在转录物水平,浓度为20 mg•L^-1的海洛因作用于C6细胞48 h时,PCNA基因的转录产物PCNA mRNA明显减少,与对照组比值为0.297（P<0.01）。结论：海洛因浓度为20 mg•L^-1时对C6细胞的增殖抑制作用接近30%,可能与海洛因成瘾形成有关。