小檗碱对胰岛β细胞的保护作用及其机制研究

 目的:探讨小檗碱对胰岛β细胞的保护作用及可能机制。方法: 采用四氧嘧啶(Axn)诱导INS-1胰岛β细胞损伤模型,并以不同浓度的硫酸小檗碱进行干预。将细胞分为对照组（Con组）、损伤组（Axn组）、低剂量小檗碱组（LBer组,小檗碱浓度为15 μmol/L）、中剂量小檗碱组（MBer组,小檗碱浓度为45 μmol/L）及高剂量小檗碱组（HBer组,小檗碱浓度为100 μmol/L）。流式细胞术观察各组细胞凋亡情况,Western blotting免疫印迹法分别观察各组PTEN/PI3K/Akt信号通路、HNF-1α/PDX-1信号通路活化情况以及激活型caspase-3的水平;酶联免疫吸附法（ELISA）观察各组基础胰岛素释放及葡萄糖刺激后胰岛素的释放水平。结果: 与Con组相比,Axn组凋亡率显著升高,但小檗碱干预后凋亡水平显著降低,且呈浓度依赖性。与Con组相比,Axn组PTEN表达水平明显升高,而PI3K/Akt活性被抑制,激活型caspase-3水平显著升高;而小檗碱处理则能逆转上述PTEN通路的促凋亡作用,且显示出浓度依赖性;与Con组相比,Axn组HNF-1α/PDX-1信号通路活性显著下降,但小檗碱处理则能提高该通路活性,表现出浓度依赖性。与Con组相比,Axn组基础及葡萄糖刺激下胰岛素释放水平均显著降低,而小檗碱处理则能显著恢复上述胰岛素释放水平,呈浓度依赖性。结论: 小檗碱对四氧嘧啶损伤的INS-1胰岛β细胞具有保护作用,表现为对其凋亡的抑制与胰岛素分泌功能的恢复,分别与影响细胞内PTEN/PI3K/Akt及HNF-1α/PDX-1信号通路有关。     

小檗碱对人高转移肺癌系（PG）细胞增殖的影响及机制研究

目的：通过离体实验初探小檗碱对高转移性人肺癌细胞株（PG）增殖能力的影响，并探讨其作用机制。 方法： 用MTT法测定小檗碱对PG细胞增殖能力的影响。用流式细胞术测定小檗碱对PG细胞细胞周期及凋亡的影响。用激光共聚焦显微镜观察小檗碱诱导PG细胞氧自由基的产生。 结果： 小檗碱能够抑制PG细胞增殖，且随药物浓度增加抑制效应增强，呈浓度依赖性(P<0.05，P<0.01)。小檗碱对PG细胞细胞周期具有阻滞作用，40 mg/L的小檗碱能引起PG细胞的凋亡。小檗碱作用6 h、12 h只有在终浓度大于或等于10 mg/L时开始产生氧自由基，低浓度的小檗碱作用24h后就能诱导氧自由基的产生。 结论： 小檗碱对PG细胞增殖具有抑制作用，后者可能与调节细胞内活性氧自由基产生从而影响细胞周期进程有关。     

G蛋白偶联受体40在游离脂肪酸影响小鼠胰岛NIT-1细胞脂性凋亡中的作用

目的： 探讨G蛋白偶联受体40（GPR40）是否介导游离脂肪酸(FFAs)对小鼠胰岛NIT-1细胞脂性凋亡的影响及其可能机制。方法: 观察棕榈酸、油酸(500 μmol/L, 48 h) 对NIT-1细胞凋亡的影响,用Hoechst 33342染色、TUNEL及流式细胞仪检测凋亡。并利用siRNA技术抑制GPR40在NIT-1细胞表达,观察棕榈酸、油酸对GPR40表达抑制细胞脂性凋亡的影响,行Western blotting观察Bcl-2、Bax和p-c-Jun表达。结果: 棕榈酸长期作用可诱导NIT-1细胞凋亡;而油酸可抑制棕榈酸对NIT-1细胞的诱导凋亡作用。 抑制GPR40表达后,空转组、control siRNA、GPR40 siRNA转染细胞分别予棕榈酸孵育48 h,3组间细胞凋亡率差异无显著;3组细胞分别予棕榈酸、油酸共孵育48 h,GPR40 siRNA转染细胞凋亡率明显高于空转组细胞,差异显著（P<0.05）,Western blotting显示这一过程伴随c-Jun磷酸化水平下降、Bcl-2、Bax表达无明显变化。结论: GPR40未参与饱和脂肪酸诱导的β细胞凋亡,而介导了不饱和脂肪酸对脂性凋亡的抑制作用,c-Jun可能参与这一过程。提示GPR40 参与调节β细胞适应性,为探讨肥胖和T2DM的关系提供了新的线索。     

TNF-α通过死亡受体途径促进IFN-γ诱导NIT-1细胞凋亡

目的：探讨TNF-α和IFN-γ对小鼠胰岛β细胞株NIT-1细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法：用MTT法检测TNF-α和IFN-γ单独或联合作用对NIT-1细胞活力的影响,倒置显微镜观察NIT-1细胞形态变化,Hoechst 33258荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞核形态的变化,Western blot技术检测凋亡相关蛋白Caspase-8,-3和PARP的活化。结果：TNF-α联合IFN-γ处理明显抑制了NIT-1细胞的活力,诱导了细胞的凋亡,促进了凋亡蛋白Caspase-8,-3和PARP的活性。结论：TNF-α通过细胞凋亡的死亡受体途径信号传递促进了IFN-γ诱导的NIT-1细胞凋亡。     

黄芪总黄酮对高糖下牛视网膜血管周细胞凋亡及凋亡基因表达的影响

目的探讨不同浓度黄芪总黄酮对高糖下原代培养的牛视网膜血管周细胞凋亡及凋亡基因表达的影响。方法以在体外培养3代近融合的牛视网膜血管周细胞为对象，分别在对照组（5．5mmol／L葡萄糖）、高糖模型组（25mmol／L）、干预组（在高糖组基础上分别加入0．5、1．0、2．0mg／ml黄芪总黄酮）中孵育6d，采用TUNEL法检测周细胞的凋亡率；RT—PCR测定Bcl-2、Bax基因的表达。结果（1）高糖下血管周细胞出现明显凋亡现象，高糖组血管周细胞凋亡率与对照组有显著差异（P〈0．01）。（2）高糖组诱导凋亡调节基因Bax表达增加，Bcl-2表达下降，与对照组有显著差异（P〈0．01）。（3）黄芪总黄酮各组血管周细胞凋亡率明显低于高糖组（P〈0．01），凋亡调节基因Bax表达下降，Bcl-2表达增加。在TFA各干预组之间，1．0mg／ml组与0．5mg／ml相比凋亡率低，Bax表达下降，Bcl-2表达增加（P〈0．01），但1．0mg／ml与2．0mg／ml组间凋亡率及凋亡基因表达无明显差异（P〉0．05）。结论黄芪总黄酮可能通过促使凋亡调节基因Bax表达下降，Bcl-2表达增加，抑制高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞凋亡。     

长期高脂喂养大鼠胰岛功能改变与胰岛炎症反应有关

目的： 观察长期高脂喂养诱导的胰岛素抵抗大鼠胰岛炎症反应水平,并探讨其与胰岛功能改变的关联及机制。方法: 8周龄的Wistar大鼠随机分为正常对照组（NC,n=15）和高脂组（HF,n=15）,分别给予普通饲料及高脂饲料喂养。24周后行高胰岛素正葡萄糖钳夹试验检测胰岛素敏感性,行静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)检测β细胞功能,以免疫组化法检测胰岛β细胞内胰岛素相对含量（IRC）以及胰岛内NF-κB与caspase-3的相对浓度,以TUNEL法检测胰岛内细胞凋亡水平,以RT-PCR法检测胰岛内胰岛素原(INS)及白细胞介素（IL）-1β mRNA的相对表达量。结果: HF组葡萄糖输注率（GIR）较NC组显著降低［(5.32±0.90) mg·kg-1·min-1 vs (7.80±0.51) mg·kg-1·min-1,P<0.01］;NC组葡萄糖负荷后胰岛素分泌高峰出现于第5 min,而HF组延迟至第10 min,且10-60 min胰岛素曲线下面积（AUCI）较NC组增加了67.7％（P<0.01）。免疫组化显示,HF组IRC较NC组减少了25.6%,NF-κB、 caspase-3相对含量及单位面积胰岛凋亡细胞数分别增加20.5％、19.1%及2.43倍(均P<0.01)。HF组胰岛IL-1β mRNA相对表达量较NC组增加了1.95倍(P<0.01),INS mRNA 表达水平增加了12.0％（P<0.05）。结论: 长期高脂喂养诱导的胰岛素抵抗大鼠胰岛存在炎症反应,可能通过NF-κB及其介导的凋亡信号通路,与早期胰岛结构及功能损害有关。     

1,25-二羟维生素D_3对胰岛β细胞免疫保护作用

目的研究1,25-二羟维生素D3对胰岛β细胞的免疫保护作用,为胰岛β细胞的免疫保护治疗提供实验依据。方法培养胰岛β细胞株NIT细胞及正常对照外周血单个核细胞,分别与以下4组作用：①（IL-1β＋IFN-γ）组,②（IL-1β＋IFN-γ＋D3）组,③D3组,④对照组（DMEM）。采用酶联免疫吸附分析（ELISA）检测培养上清液中IL-4、IFN-γ水平,用硝酸还原酶法检测上清液NO水平,用化学发光法检测上清液胰岛素水平。结果①IL-1β＋IFN-γ＋D3刺激的NIT-1细胞与IL-1β＋IFN-γ刺激组相比,分泌IL-4水平增高（P〈0.01）、IFN-γ减少（P〈0.01）,IL-4/IFN-γ增高（P〈0.01）;②IL-1β＋IFN-γ＋D3刺激的NIT-1细胞与IL-1β＋IFN-γ刺激组相比,分泌NO水平减少（P〈0.01）;③IL-1β＋IFN-γ＋D3刺激的NIT-1细胞与IL-1β＋IFN-γ刺激组相比,胰岛素分泌增加（P〈0.05）。结论 1,25-二羟维生素D3可减轻IL-1β＋IFN-γ对NIT细胞的损伤作用,保护NIT细胞的胰岛素分泌功能。     

K+通道阻断剂四乙铵对胰岛β-细胞凋亡的作用机制研究

目的 研究K^＋通道阻断剂四乙铵（TEA）对诱导胰岛β-细胞凋亡的作用及机制。方法 以IFN-γ＋IL-1β诱导NIT细胞凋亡,同时加入TEA,通过AnnexinV检测、PI染色,利用四唑蓝比色实验（MTT法）检测不同浓度TEA对链脲佐菌素（STZ）处理细胞活性的影响;使用流式细胞术检测TEA对诱导NIT细胞凋亡的影响;通过硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸TBA法、化学比色法、黄嘌呤氧化酶法、分别测定培养上清液中NO和氧自由基含量以及细胞裂解物中NO合成酶（NOS）及超氧化物歧化酶（super oxide dismutase,SOID）活性。结果 1mmol／L TEA能显著抑制IFN-γ＋IL-1β诱导的NIT细胞凋亡。IFN-γ＋IL-1β可显著增加NOS活性,降低SOD的活性,从而导致培养上清液中NO及氧自由基的含量显著增加;TEA可显著抑制STZ的作用。结论K^＋通道在胰岛β-细胞的凋亡中可能起着重要作用;K^＋通道阻断剂TEA可显著抑制IFN-γ＋IL-1β诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制可能与下调NIT细胞诱导性NO合成酶（iNOS）活性,上调SOD活性,减少NO的产生以及增强其清除氧自由基的能力有关。     

L-carnosine对NIT-1胰岛细胞的影响及机制

目的: 研究肌肽(L-carnosine)对高糖培养的NIT-1细胞胰岛素分泌、增殖和凋亡的影响及机制。方法:(1)正常和高糖培养细胞72 h,放射免疫法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌,然后分别换不同浓度葡萄糖和L-carnosine培养,测定胰岛素分泌;(2)细胞分为C组(11.1 mmol/L glucose)、H组 (33.3 mmol/L glucose)、H+A组(33.3 mmol/L glucose +1 mmol/L L-carnosine)和H+B(33.3 mmol/L glucose+ 20 mmol/L L-carnosine)组培养72 h,BrdU检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡,RT-PCR测定bcl-2和caspase-3 mRNA的表达,荧光法检测caspase-3活性。结果:(1)高糖组细胞胰岛素分泌减少; 20 mmol/L L-carnosine显著增加正常和高糖组胰岛素分泌(P<0.01),且呈正相关(P<0.01);(2)高糖组细胞增殖和凋亡均增加(均P<0.01),但总体数目减少;1 mmol/L L-carnosine使增殖增加,凋亡减少(P<0.01);(3) 高糖组caspase-3 mRNA表达明显增加,bcl-2 mRNA明显减少(P<0.05);1 mmol/L L-carnosine使前者明显减少(P<0.05),后者明显增加(P<0.01);不同浓度L-carnosine均明显降低caspase-3活性。结论: 高浓度L-carnosine可单独刺激细胞分泌胰岛素,低浓度的L-carnosine可增加NIT-1细胞增殖并减少高浓度葡萄糖所导致的凋亡。Caspase-3和Bcl-2可能参与了L-carnosine保护NIT-1细胞的过程。     

小檗碱对人高转移肺癌细胞与脐静脉内皮细胞黏附的影响

目的： 探讨小檗碱对人高转移肺癌细胞株PG细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）黏附的影响及其机制。方法：用MTT法检测不同浓度（2.5-40 mg/L）的小檗碱对HUVECs增殖的影响,用2.5、5和10 mg/L小檗碱分别处理人高转移肺癌细胞株PG细胞6、12和24 h, 用虎红染色法测定小檗碱对PG细胞与HUVECs黏附能力的影响, 用荧光抗体染色法测定小檗碱对PG细胞表面黏附分子CD44s表达的影响, 用双光子各向异性度成像系统观察小檗碱对PG细胞膜流动性的影响。结果：（1）2.5、5和10 mg/L小檗碱作用HUVECs 6、12和24 h后对其生长无影响。（2）用不同浓度小檗碱处理PG细胞6、12和24 h后,与TNF-α刺激后的HUVECs相互作用后,能够显著抑制其黏附率,且呈浓度依赖性(P<0.05, P<0.01)。（3）各剂量组的小檗碱均能使PG细胞表面的CD44s分子表达增高（P<0.05或P<0.01）。（4）小檗碱作用PG细胞24 h后能够抑制PG细胞膜的流动性,且随药物浓度的升高这种抑制作用增强。结论：小檗碱对PG细胞与HUVECs的黏附具有抑制作用,可能与小檗碱增加PG细胞表面黏附分子表达、降低其细胞膜流动性有关。     

辛伐他汀对高糖高脂诱导人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

背景：研究表明,他汀类药物能够促进骨髓间充质干细胞的增殖与黏附能力,抑制高糖高脂培养下骨髓间充质干细胞的凋亡。 目的：观察辛伐他汀对高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 方法：将0.001,0.01,0.1,1.0 μmol/L辛伐他汀分别与高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞培养48 h,以正常培养骨髓间充质干细胞及高糖高脂诱导条件下培养的骨髓间充质干细胞为对照。倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法比较不同浓度辛伐他汀对高糖高脂环境下骨髓间充质干细胞存活率的影响,应用流式细胞术检测细胞凋亡,加入PI3K/Akt信号转导通路抑制剂LY294002后辛伐他汀对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 结果与结论：与高糖高脂诱导组比较,辛伐他汀0.01,0.1,1.0 µmol/L组骨髓间充质干细胞存活率均升高(P < 0.01),其中辛伐他汀浓度在0.1 μmol/L时骨髓间充质干细胞存活率升高最显著(P < 0.01);同时流式细胞仪检测结果显示,辛伐他汀0.01,0.1,1.0 µmol/L组细胞凋亡率下降(P< 0.01),其中0.1 µmol/L组凋亡率下降最显著(P < 0.01)。0.1 µmol/L辛伐他汀对骨髓间充质干细胞的影响可被LY294002阻断。说明辛伐他汀能抑制高糖高脂诱导条件下骨髓间充质干细胞的凋亡,其机制可能与PI3K/Akt信号途径有关。     

5-氟尿嘧啶改变胰岛β细胞的超微结构并抑制胰岛素的释放

目的: 探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)抑制小鼠胰岛β细胞(NIT-1细胞)胰岛素分泌的相关分子机制。方法: 不同剂量的5-FU作用于NIT-1细胞,放射免疫分析法检测细胞胰岛素分泌功能的变化;Annexin V/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;透射电镜观察细胞超微结构的变化;RT-PCR及Western blotting 检测胰十二指肠同源盒蛋白-1(PDX-1)mRNA和蛋白的表达。结果: 5.0-40.0 mg/L的5-FU作用24 h后,低浓度葡萄糖(5.6 mmol/L)环境下,NIT-1细胞胰岛素分泌无明显下降(P>0.05);而高浓度葡萄糖(16.7 mmol/L)刺激下的胰岛素分泌量可被5.0-40.0 mg/L 5-FU以剂量依赖性的方式所抑制(P<0.01)。细胞凋亡率明显增高(P<0.05);透射电镜可见线粒体结构改变;经10.0-40.0 mg/L的5-FU作用24 h后,PDX-1 mRNA及蛋白表达的水平均有不同程度的下降(P<0.05)。结论: 5-FU可通过诱导细胞凋亡、导致β细胞超微结构改变及数量减少而抑制胰岛β细胞高糖刺激下的胰岛素释放。下调 PDX-1 基因表达可能是5-FU在高糖条件下诱导β细胞凋亡的机制之一。     

PPARδ激动剂GW501516抑制ox-LDL或高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

目的: 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂GW501516对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的抑制作用。方法: ox-LDL或高糖诱发HUVECs凋亡,给予不同浓度GW501516处理后,用流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。采用MTT法检测ox-LDL或高糖对HUVECs生长活性的影响,用不同浓度GW501516干预后观察细胞生长活性的变化。结果: ox-LDL诱导的细胞凋亡率是21.30%,不同浓度GW501516处理组凋亡率分别为17.47%、9.72%和3.94%,高糖诱导的细胞凋亡率为22.65%,不同浓度GW501516处理组凋亡率分别为20.23%、17.01%和9.38%,结果显示GW501516可抑制ox-LDL或高糖诱导的细胞凋亡,且呈剂量依赖性;MTT结果显示,GW501516可使ox-LDL或高糖对HUVECs活性的抑制作用减弱。结论: GW501516可抑制ox-LDL或高糖诱导的HUVECs凋亡;并减弱ox-LDL或高糖对HUVECs活性的抑制作用。     

雷帕霉素对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的:评价雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,探讨其在糖尿病肾病防治中的意义。方法:体外培养的大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1 分为:正常对照组、高糖组、高糖加不同浓度的雷帕霉素组,应用CCK-8 法观察细胞增殖的变化;流式细胞术检测各组细胞的细胞周期和凋亡情况;Real-time PCR 法检测各组细胞中血管紧张素 (ANG )、转化生长因子β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果:高糖诱导下HBZY-1 的增殖水平明显上升,凋亡水平下降,ANG ,TGF-β1 和VEGF 的表达水平上升,而雷帕霉素具有明显抑制作用,且有剂量依赖性,并下调ANG ,TGF-β1 和VEGF 的表达;对于细胞周期,高糖组的S 期细胞明显高于正常组(P<0.05);雷帕霉素干预后,S 期细胞比例减少(P<0.05)。结论:雷帕霉素能够抑制高糖状态下HBZY-1 的增殖,促进其凋亡及导致G1/ S 期阻滞,同时下调ANG ,TGF-1β和VEGF 的表达。     

DHA通过抑制PI3K通路和GLUT2表达而诱导NSCLC细胞毒性

目的:研究二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)诱导NSCLC细胞毒性的分子机制。方法:将不同浓度的DHA作用NSCLC细胞系A549和NCI-H1650细胞不同时间,运用MTT法、克隆形成实验、Annexin V染色和流式细胞术测定DHA对细胞活力、克隆形成能力和细胞凋亡的影响;同时测定DHA对细胞中葡萄糖水平、ATP和乳酸含量的影响;Western blot检测PI3K通路活性和GLUT2表达变化;通过细胞转染实现葡萄糖转运体2(GLUT2)和Rheb在A549和NCI-H1650细胞中高表达,测定和分析DHA作用下细胞活力、细胞凋亡、葡萄糖水平、ATP含量和PI3K通路活性的变化;分析葡萄糖缺乏对DHA诱导NSCLC细胞毒性的影响。结果:与对照组比较,DHA显著抑制A549和NCI-H1650细胞活力和克隆形成能力以及诱导细胞凋亡,同时降低ATP和乳酸含量以及抑制细胞对葡萄糖的摄取,具有时间和剂量依赖效应。Western blot结果显示,DHA能抑制PI3K通路活性和GLUT2的表达。上调GLUT2的表达和激活PI3K通路能减弱DHA对NSCLC细胞的毒性作用;葡萄糖缺乏能增强DHA对NSCLC细胞的毒性;相反,高浓度葡萄糖则抑制DHA对NSCLC细胞的毒性。结论:DHA能抑制NSCLC细胞活力和克隆形成,诱导细胞凋亡,该作用是通过降低PI3K活性和GLUT2的表达进而抑制细胞糖酵解代谢实现的。     

Pyruvate kinase,muscle isoform 2 promotes proliferation and insulin secretion of pancreatic β-cells via activating Wnt/CTNNB1 signaling

Failure of pancreatic β-cells is closely associated with type 2 diabetes mellitus (T2DM), an intractable disease affecting numerous patients. Pyruvate kinase, muscle isoform 2 (PKM2) is a potential modulator of insulin secretion in β-cells. This study aims at revealing roles and possible mechanisms of PKM2 in pancreatic β-cells. Mouse pancreatic β-cell line NIT-1 was used for high glucose treatment and PKM2 overexpression by its specific expression vector. Cell proliferation by Thiazolyl blue assay, cell apoptosis by annexin V-fluorescein isothiocyanate/prodium iodide staining and insulin secretion assay by ELISA were performed in each group. The mRNA and protein levels of related factors were analyzed by real-time quantitative PCR and western blot. Results showed that Pkm2 was inhibited under high glucose conditions compared to the untreated cells (P < 0.01). Its overexpression significantly suppressed NIT-1 cell apoptosis (P < 0.01), and induced cell proliferation (P < 0.05) and insulin secretion (P < 0.05). Related factors showed consistent mRNA expression changes. Protein levels of β-catenin (CTNNB1), insulin receptor substrate 1 (IRS1) and IRS2 were all promoted by PKM2 overexpression (P < 0.01), indicating the activated Wnt/CTNNB1 signaling. These results indicated the inductive roles of PKM2 in pancreatic β-cell NIT-1, including promoting cell proliferation and insulin secretion, and inhibiting cell apoptosis, which might be achieved via activating the Wnt/CTNNB1 signaling and downstream factors. This study offers basic information on the role and mechanism of PKM2 in pancreatic β-cells, and lays the foundation for using PKM2 as a potential therapeutic target in T2DM.