二磷酸盐对成骨细胞增殖及分化成熟作用的实验研究

目的研究二磷酸盐类药物—阿伦磷酸对成骨细胞增殖及分化成熟的作用。方法将人成骨样MG-63细胞体外培养、传代后分为5组:空白对照组、阳性对照组(加入10-8M地塞米松)、3个实验组(分别加入10-6M、10-8M、10-10M阿伦磷酸)。培养数日后,行细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、骨形态发生蛋白-(2BMP-2)、骨钙素(OC)、I型胶原(Coll.I)基因表达等检测。结果加入阿伦磷酸的3个实验组MG-63细胞数目较对照组显著增加,其峰值出现在浓度为10-8M时;同时,阿伦磷酸使ALP活性增强,而且BMP-2、OC、Coll.I等成骨细胞相关基因的表达增加。结论阿伦磷酸具有促进成骨细胞增殖及分化成熟,诱导骨形成的能力。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞体外培养的生长特点和诱导条件下的成骨能力.方法:通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用.结果:骨髓基质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速.诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节.结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞.     

条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的 :观察条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响。　方法 :分离兔骨髓 ,培养骨髓基质细胞 ,传代细胞分别用标准培养液和加入 β 甘油磷酸钠 ,地塞米松和抗坏血酸制成的条件培养液培养 ,观察不同培养液下骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。　结果 :在条件培养液下 ,骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量明显高于标准培养液下的含量。　结论 :条件培养液有助于骨髓基质细胞向成骨细胞的分化和增殖     

富血小板血浆诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨富血小板血浆（PRP）在体外定向诱导脂肪干细胞向成骨细胞增殖分化的可行性。方法体外分离培养兔脂肪干细胞,传至第3代分为两组：对照组加入含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸、1×10^-8mol/L地塞米松;实验组在此基础上加入10ml/L富血小板血浆进行诱导培养。观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色和茜素红染色检测矿化结节的形成。结果实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后,形态规则、多角型细胞增多,细胞倍增时间明显短于对照组。诱导7、10、14d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组（P〈0.01）。诱导21d与对照组比较,实验组形成的矿化结节数量增多,结节增大。结论在体外PRP能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化。     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的 研究大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法 使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松（Dex)10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠（β-GP）10mmol/L,抗坏血酸（AA）50μg/ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明,rMSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,利用MTT法和流式细胞术（FCM）测定增殖的结果表明,传代次数增加,rMSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨、在诱导3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示,非诱导条件下MSCs的碱性磷酸酶（ALP）水平会随传代而升高,传3代rMSCs的ALP的表达较弱,诱导一周后ALP的表达明显升高,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞（OB）的ALP表达。结论 本实验表明所培养的rMSCs仍处于低分化水平,具有骨祖细胞的特性。     

三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2表达及碱性磷酸酶活性的影响

研究三七总皂甙(PNS)对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2(BMP-2)表达及碱性磷酸酶活性的影响,探讨其在骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化中的作用机制。方法分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),实验按不同质量浓度PNS分组(0、50、100、150、200mg.L-1),以0mg.L-1为对照组。均采用成骨诱导液培养,MTT法观察细胞增殖,ALP活性测定,Western Blotting检测细胞BMP-2表达。结果在第3、5天各组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05),在第7、9天,50、100、150mg.L-1组高于对照组(P<0.05);BMP-2表达水平及ALP活性在50、100及150mg.L-1组高于对照组(P<0.05),对照组少量表达BMP-2;200mg.L-1组细胞增殖、BMP-2表达水平及ALP活性与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论三七总皂甙可通过上调BMP-2的表达水平,增强碱性磷酸酶活性,促进骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化。     

芹菜素对人牙髓间充质细胞增殖和成骨分化的影响

目的 探讨芹菜素对人牙髓间充质细胞(hDPSCs)增殖与成骨分化的影响.方法 CCK-8法检测不同浓度芹菜素对hDPSCs增殖的影响;碱性磷酸酶活性检测及碱性磷酸酶染色(ALP)和茜素红染色观察芹菜素对hDPSCs矿化能力的影响;Real-time PCR检测芹菜素影响下hDPSCs成骨向分化相关基因表达情况.构建兔颅骨缺损模型(4个直径8 mm圆形缺损),分四组:空白组、骨粉组、普通培养的hDP-SCs复合骨粉组、含5μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组.术后4、8周取标本行Micro-CT测量骨体积分数.结果 CCK-8检测显示5μmol/L芹菜素对hDPSCs增殖影响最优;茜素红染色结果显示5 μmol/L芹菜素组钙结节的数量明显增多,碱性磷酸酶活性显著提高(P＜0.001);PCR结果显示5 μmol/L芹菜素组RUNX2和OCN表达上调.Mi-cro-CT显示在4、8周含5μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组的新骨形成较普通培养的hDPSCs复合骨粉组多,空白组与骨粉组成骨效果不明显.结论 芹菜素能促进hDPSCs的增殖和成骨分化,为临床治疗牙周骨缺损提供新思路.     

基因沉默组织型转谷氨酰胺酶抑制SaOS-2细胞成骨分化

目的 研究组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase, TG2）是否参与人SaOS-2细胞系成骨分化过程。方法 使用携带短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）的慢病毒转染SaOS-2细胞以敲减TG2表达，以SaOS-2细胞及转染了含阴性对照shRNA病毒的SaOS-2作为对照组，分别进行体外成骨诱导培养，并进行以下检测：1）诱导14 d后各组矿化情况（茜素红染色），2）诱导4 d、7 d后碱性磷酸酶活性及I型胶原、骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的mRNA表达，并与诱导前的表达水平相比较。结果 SaOS-2细胞组及转染阴性对照shRNA组在体外成骨诱导过程中I型胶原、骨钙素、BMP-2的mRNA表达和ALP活性逐渐增加，14 d时形成明显矿化结节，而TG2敲减后的SaOS-2细胞在诱导14 d时矿化水平显著低于对照组，诱导7 d时ALP活性及I型胶原、骨钙素、BMP-2的mRNA表达水平显著低于对照组。结论 组织型转谷氨酰胺酶参与SaOS-2细胞体外成骨分化及矿化。     

阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导的研究

目的:探讨不同浓度阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导增殖和成骨诱导分化能力的影响.方法:取生长状态良好的第四代细胞,分为实验组(不同浓度的阿仑膦酸钠,A-F组)、空白对照组(L-DMEM,G组)和阳性对照组(地塞米松,H组)各自诱导成骨分化.观察细胞形态,放射免疫法检测各组hBMSCs骨钙素的分泌能力,实时荧光定量PCR检测各组细胞培养液中Runx2和Osx mRNA的表达情况,并检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶(LPL)mRNA的表达情况.结果:hBMSCs诱导分化至第7天时,A-F组大部分细胞仍呈长梭形,G组部分细胞开始出现形态学改变;各组细胞培养基中骨钙素均随诱导分化时间推移而增多;各组细胞表达Osx和Runx2 mRNA也随诱导分化时间推移而增多;hBMSCs经诱导分化21 d时,A-F组细胞Osx和Runx2 mRNA表达量进一步增加,E组和F组超过半数细胞阳性表达,高于其他阿伦磷酸钠工作液诱导组;在阴性对照组,始终未见有细胞形态学改变、骨钙素表达和Osx和Runx2 mRNA表达.结论:ALN能促进hBMSCs增殖和骨向分化,1×10-6mol/L为其诱导分化的合适浓度.     

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的 观察糖尿病大鼠模型骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖、抗凋亡和成骨分化能力。方法 将40只6周龄雌性SD大鼠随机分为2组,每组20只,实验组腹腔注射链脲佐菌素,对照组注射等量的生理盐水。处理10周后,采用贴壁法获得2组大鼠的BMSCs。应用CCK-8检测第2代BMSCs增殖能力,0.3%过氧化氢和血清剥夺诱导的BMSCs凋亡;成骨诱导培养4周后, RT-PCR检测I型胶原蛋白(COL-I)、骨钙素(OCN)和核心结合蛋白因子-2(Runx-2)的mRNA表达水平;应用酶联免疫吸附法定量分析细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及von Kossa染色分析矿化能力。结果 链脲佐菌素成功诱导制备糖尿病大鼠模型。与对照组比较,实验组BMSCs增殖和抗凋亡能力降低,细胞成骨相关基因表达下降,细胞碱性磷酸酶活性显著降低,细胞成骨分化能力减弱(P<0.01)。结论 糖尿病大鼠来源的BMSCs体外增殖、抗凋亡作用减弱,成骨分化能力显著下降。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

体外诱导细胞转化为胰岛细胞的研究进展

巢素蛋白（nestin）阳性细胞、成体干细胞（包括间充质干细胞和胰腺导管上皮细胞）和胚胎干细胞是常用的体外诱导转化为胰岛细胞的种子细胞,本文就这三类细胞的来源、实验方法及实验结果的研究进展进行综述。     

外源性褪黑激素对小鼠生精细胞凋亡的影响

目的 观察褪黑激素对生精细胞凋亡的影响。方法 HE染色、TUNEL测定(核快红复染)。结果 HE染色下睾丸间质细胞的面积随褪黑激素的增多而减小，与睾酮的浓度变化相一致。TUNEL阳性细胞随褪黑激素的增加有增多的趋势，但超过一定量后(100ug)，不再增多。20～30d的处理组呈现与30～40d的处理组不同的结果。结论 外源性褪黑激素具有促进生精细胞凋亡的作用。这种作用与其对睾酮的抑制作用不相一致。     

大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

人BMSCs移植小鼠睾丸后向Leydig细胞或产类固醇激素细胞诱导分化的实验研究

目的 研究人体骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）在体内条件下能否向Leydig细胞或产类固醇激素细胞定向诱导分化,及是否发生免疫排斥反应。方法 将分离培养获得的第3代BMSCs经核荧光标记物标记后,制备成细胞悬液,注射至经二甲磺基乙烷(EDS)处理后的20只BALB/c小鼠睾丸内。从移植BMSCs前1 d开始,每隔2 d处死1只小鼠,测尾静脉游离睾酮浓度,对照组为同期未作任何处理BALB/c小鼠20只。同时睾丸组织经荧光显微镜摄片,追踪观察BMSCs,行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)单克隆抗体和鼠抗人细胞核单克隆抗体双重免疫荧光检测,寻找3β-HSD和鼠抗人细胞核单克隆抗体荧光染色均阳性的细胞。结果 EDS对小鼠Leydig细胞有一定杀伤作用;采用睾丸网注射法行人BMSCs移植小鼠睾丸获得了成功,未见免疫排斥反应;移植BMSCs后的睾丸组织未检测到3β-HSD和鼠抗人细胞核单克隆抗体免疫荧光染色均阳性的细胞。结论 采用人BMSCs移植小鼠睾丸的方法获得成功,未见免疫排斥反应,移植后的BMSCs未向Leydig细胞或产类固醇细胞定向分化。     

耳蜗前体细胞体外培养和诱导分化的实验研究

目的通过体外定向诱导耳蜗前体细胞分化，明确耳蜗前体细胞的位置取材，来源及增殖分化特性．建立完善的耳蜗前体细胞的培养体系。方法取耳蜗的Corti器位置，利用无血清培养和单细胞克隆技术，进行细胞培养，在相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，并用神经巢蛋白（nestin）、溴脱氧尿嘧啶（Brdu）、MyosinⅦA、P27^KIP1等免疫荧光方法。鉴定耳蜗前体细胞和由耳蜗前体细胞分化而来的内耳毛细胞和内耳支持细胞。同时进行细胞计数。结果从新生大鼠耳蜗分离的组织．经原代和传代培养后，可获得大量未分化，悬浮生长的Nestin阳性细胞团，并具有增殖的能力，诱导分化后的细胞经免疫荧光双标实验可表达Brdu、MyosinⅦA和P27^KIP1阳性。流式细胞仪细胞计数后，发现前体细胞向内耳毛细胞诱导分化的数量较少，向支持细胞分化的较多。结论从新生大鼠耳蜗分离的细胞是具有自我更新和分化潜能的前体细胞，可诱导分化为内耳毛细胞和内耳支持细胞。