Expression of Beclin1 in osteosarcoma and the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity

To explore the expression of Beclin1 in osteosarcoma and investigate the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity to cisplatin （DDP）, the expression of Beclin1 in 28 specimens of osteosarcoma （group A） and 19 specimens of normal bone tissues （group B） were immunohistochemically detected. The expression of Beclin1 mRNA in MG63 cells treated with different concentrations of DDP was examined with RT-PCR. After down-regulation of autophagy in MG63 cells by an autophagy inhibitor, 3-methyladenine （3-MA）, the cell proliferation inhibition rate of MG63 cells treated with DDP was evaluated by using the MTT assay. The positive rates of Beclin1 were 67.85% in group A and 94.73% in group B. Its expression was lower in osteosarcoma than in normal bone tissues, with a significant difference found between them （P〈0.05）. RT-PCR showed that the expression of Beclin1 mRNA in the cells treated with high-dose DDP were higher than that in the non-treated cells, and no significant difference in the expression of Beclin1 mRNA was found between the cells treated with low-dose DDP and the non-treated cells. There was a positive correlation between the level of Beclin1 mRNA expression and the concentration of DDP. MTT assay showed that the proliferation inhibition rates of the cell treated with 3-MA and DDP combined were substantially increased when compared with those treated with DDP alone （P〈0.01）. This study demonstrated that autophagy may be implicated in the carcinogenesis of osteosarcoma, and DDP may induce autophagy in the MG63 cells. It also suggests that the down-regulated autophagy could increase chemotherapeutic sensitivity of DDP to osteosarcoma.     

顺铂诱导骨肉瘤细胞自噬及其与凋亡关系的体外研究

目的研究顺铂(DDP)诱导的骨肉瘤细胞自噬性活化,并探讨自噬与凋亡的关系。方法利用免疫荧光染色和电镜观察DDP对骨肉瘤细胞自噬的影响;应用3-甲基腺嘌呤(3MA)下调自噬,采用MTT比色法,测定DDP对骨肉瘤细胞增殖抑制率的影响;MDC荧光染色和流式细胞术定量检测骨肉瘤细胞自噬的表达;应用流式细胞仪检测骨肉瘤细胞的凋亡情况。结果 DDP给药后可见LC3-Ⅱ绿色荧光呈点状散在分布于细胞膜附近。电镜下观察到DDP给药后骨肉瘤细胞内自噬体的形成。DDP能诱导自噬和凋亡的发生。3MA能抑制自噬的发生,对凋亡无明显影响。与单独DDP作用相比,3MA提前给药细胞的凋亡率增加,其细胞增殖抑制率也增高;3MA迟后给药细胞的凋亡率略有下降,其细胞增殖抑制率也下降。结论 DDP能诱导MG63细胞发生自噬性活化。DDP作用早期,自噬能延缓凋亡的发生,发挥保护细胞的作用;在DDP作用后期,自噬则作为另一种死亡形式出现,和凋亡一起促进细胞死亡。     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后自噬水平变化及其与细胞凋亡的关系

目的研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后自噬水平的变化规律,通过对Caspase-3的检测探讨自噬水平变化对细胞凋亡的影响。方法将实验动物分为假手术组、模型组、3．甲基腺嘌呤组及雷帕霉素组,采用Rice法建立HIBD模型-3．甲基腺嘌呤组及雷帕霉素组于造模后0．5h腹腔注射3．甲基腺嘌呤及雷帕霉素。应用免疫组织荧光化学法检测损伤侧大脑海马及皮层组织自噬相关蛋白Beclin1的表达,Western—blot法检测Beclin1表达变化规律,免疫组织化学法检测各组Caspase-3的表达。结果免疫组织荧光化学检测结果显示,缺氧缺血性脑损伤后能激活自噬现象发生。Western．blot检测结果显示,HIBD后2hBeclin1蛋白表达开始增加,24h达到高峰,持续到168h。免疫组织化学检测结果显示,3-甲基腺嘌呤组时间点Caspase-3阳性表达显著升高,雷帕霉素组Caspase-3阳性表达显著下降。结论新生大鼠HIBD模型能激活自噬现象发生,自噬水平增高可抑制细胞凋亡,自噬水平降低可增加细胞凋亡。     

三七总皂苷对顺铂诱导肾损伤大鼠模型自噬蛋白LC3和Beclin1的影响

目的研究三七总皂苷（PNS）对顺铂诱导肾损伤大鼠肾组织中自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达的影响。方法将36只雄性SD大鼠随机分为空白对照组,顺铂模型组,顺铂 PNS组,在给药24 h后处理动物,检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(NAG)水平,利用透射电镜观察大鼠肾小管上皮细胞粒体形态及自噬体,通过Western blot检测自噬蛋白LC3和Beclin1蛋白的表达。结果大鼠暴露于顺铂24 h后,与空白对照组比较,顺铂模型组血清Cr、BUN显著升高（P<0.05）,尿NAG水平没有明显变化,电镜观察到自噬体出现,肾组织LC3和Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.01）。与顺铂模型组比较,顺铂 PNS组血清Cr明显降低（P<0.05）,LC3和Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.01）。结论PNS可能通过提高Beclin1的表达,增强肾组织的自噬而降低顺铂诱导的大鼠肾损害。      

自噬基因Beclin 1在宫颈鳞癌中的蛋白表达及其临床意义

目的探讨自噬基因Beclin 1在宫颈鳞癌中的蛋白表达以及与肿瘤发生发展的关系。方法采用免疫组化SP法检测81例宫颈鳞癌、20例宫颈上皮内瘤样病变（CIN,Ⅱ～Ⅲ级）和20例正常宫颈组织中自噬基因Beclin 1的蛋白表达。结果宫颈鳞癌组织中Beclin 1阴性、弱阳性、强阳性表达率依次是43．2％（35／81）、34．6％（28／81）、22．2％（18／81）,与正常宫颈和宫颈上皮内瘤样病变组相比,Beclin 1在宫颈鳞癌中的表达显著下调（P=0．011）。宫颈鳞癌中Beclin 1的表达在不同FIGO分期、年龄、宫颈肌层浸润深度、宫颈肿瘤大小、大体类型间的差异无统计学意义。但在有无盆腔淋巴结转移、不同肿瘤分化程度间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论自噬基因Beckn 1在宫颈鳞癌中蛋白表达下调,并与宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移和肿瘤分化程度有关。     

不同分期肺癌组织中Beclin1、p53、p16表达情况分析

目的本文旨在通过对肺癌组织中Beclin1、p53和p16表达的分析,为肺癌早期诊断及其恶性度评估提供可靠数据。方法选择2009年1～12月在山西省汾阳医院就诊的肺癌患者,取肺组织50例,检测样本中不同分期肺癌组织Beclin1、p53、p16的表达情况,对该表达情况与对应的分期进行方差分析与ISD—f检验。结果不同肺癌分期的Beclinl、p53、p16的表达情况之间的差别有统计学意义（P〈0．05）。结论肺癌各临床分期的Beclin1、p53、p16表达情况不一样。随肺癌分期的增高p53表达量增高,p16表达量下调,Beclin1表达量降低。     

Beclin1和 LC3在胃癌组织中的表达水平和临床意义

目的：探讨胃癌相关组织中自噬相关基因 Beclin1和微管相关蛋白轻链 LC3的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化 PV 法检测61例胃癌组织及相应的癌旁组织中 Beclin1和 LC3的表达水平,分析其与胃癌多种临床病理参数的关系。结果：免疫组化染色结果示,胃癌中 Beclin1的阳性表达率为37.7%,LC3的阳性表达率为41.0%,癌旁组织的阳性表达率分别为98.4%、93.4%,癌组织明显低于癌旁组织;Beclin1和 LC3的表达水平与胃癌的淋巴结转移、浸润深度、分化程度、肿瘤 TNM分期有关,而与年龄、性别和肿瘤生长部位无相关性;胃癌组织中 Beclin1和 LC3表达成正相关。结论：胃癌组织中 Beclin1和 LC3的表达率显著低于癌旁组织,两者之间的关系呈正相关,两者均与胃癌的发生发展有重要的关系。利用自噬调节药物对胃癌的治疗也许具有可行性。     

Expression of Beclin1 in non small cell lung cancer and its clinical significance

Objective:To investigate the expression of autophagy related gene;Beclin1 in human non-small cell lung cancer(NSCLC)tissues.Methods:Protein expression of Beclin1 was determined by immunofluorescence staining and Western Blot,mRNA expression was analyzed by RT-PCR.Results:Immunofluorescence staining revealed that the level of Beclin1 expression in lung cancer was significantly lower than that in adjacent noncancerous tissues and normal tissues(expression rate 8.3%,P=0.000).The Beclin1 mRNA expression in lung cancer,adjacent noncancerous tissues and normal tissues was 1.372(±0.475)1.721(±0.521)and 1.553(±0.554)when F = 15.0,P < 0.01.Beclin1 protein expression in lung cancer,adjacent noncancerous tissues and normal tissues was 3.453(±0.852)5.423(±1.351)and 6.878(±0.997)F = 11.2,P < 0.01.Conclusion:The protein and mRNA expression of Beclin1 in lung cancer was much lower than those in and around cancer tissues and normal tissues,those differences having statistical significance.However in adjacent noncancerous tissues and normal tissues,the expression showed no difference.     

Survivin、Caspase-3、cyclinD1在骨肉瘤中的表达及临床意义

目的研究Survivin、Caspase-3、cyclinD1在骨肉瘤中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化S-P法检测36例骨肉瘤中Survivin、Caspase-3、cyclinD1的表达水平以及Survivin与Caspase-3、cyclinD1两者之间的相关性,并对所有病例进行随访。10例骨软骨瘤为对照组。结果①Survivin在骨肉瘤中的阳性率为63.7%(23/36),明显高于对照组骨软骨瘤10.0%(1/10)的阳性率,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);Caspase-3在骨肉瘤中的阳性表达率为52.8%(19/36),而在骨软骨瘤中为90.0%(9/10),两者相比差异有统计学意义(P<0.01);cy-clinD1蛋白在骨肉瘤中的阳性率为74.4%(29/36),高于在骨软骨瘤中的40.0%(4/10),两者相比差异有统计学意义(P<0.05);前2者表达部位在细胞浆,cyclinD1表达于细胞核。②Survivin和Caspase-3表达强度之间呈显著负相关(r=-0.46,P<0.01)。③Survivin与cyclinD1表达呈正相关(r=0.641,P<0.01)。结论①...     

二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase,QDPR)对HEK293T细胞自噬作用的影响。方法构建野生型QDPR和突变型QDPR重组质粒分别转染HEK293T细胞,并设空载体对照组。采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量变化。结果 1)测序结果证实PCR扩增得到编码正常QDPR的cDNA序列正确以及突变的cDNA也在正确的位置突变;2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,野生型QDPR和突变型QDPR融合蛋白成功表达;3)RT-PCR结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调(P0.05),突变型QDPR组LC3基因水平与对照组相比无统计学差异;与对照组相比,野生型和突变型组Beclin1基因水平无统计学差异;4)Western blot结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclin1的蛋白表达量明显上调(P0.05),但LC3-I的蛋白表达量无统计学差异,突变型QDPR组与对照组相比LC3-I,II和Beclin1的蛋白表达量均没有统计学差异(P0.05)。结论二氢生物喋呤还原酶能增强HEK293T细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1的表达,提示其可能具有激活自噬作用的功能;二氢生物喋呤还原酶93位氨基酸的突变影响了其对细胞自噬作用的调控,降低了自噬标志分子LC3-I和Beclin1的基因表达。     

上皮性卵巢癌中自噬基因Beclin 1的表达及其调控相关信号传导途径的研究

目的 研究自噬基因Beclin 1及其调控相关信号传导途径磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)与上皮性卵巢癌发生发展之间的关系.方法 用免疫组化的方法对25例正常卵巢组织、25例良性上皮性卵巢肿瘤、19例交界性上皮性卵巢肿瘤及69例上皮性卵巢癌组织进行Beclin 1、Class Ⅰ PI3K (p110α)、Class Ⅲ PI3K(hvps34)及其下游的磷酸化PKB(p-PKB)的表达水平进行检测.结果 Beclin 1、hvps34在正常卵巢组织与良性卵巢肿瘤组织中表达较高,在交界性卵巢肿瘤组织中开始下降,在上皮性卵巢癌中的表达最低(P＜0.05);p110α、p-PKB在交界性卵巢肿瘤组织中开始升高,在上皮性卵巢癌中的表达高于其它3组(P＜0.05).卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期、高中分化、淋巴结无转移的卵巢肿瘤组织中Beclin 1的表达分别高于Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴结有转移者(P＜0.05),而p110α及p-PKB的表达则分别降低(P＜0.05).结论 自噬基因Beclin 1在上皮性卵巢癌中的表达下调,对自噬起调控作用的PI3K/PKB信号通路中的成分p110α、hvps34、p-PKB存在表达异常,可能与上皮性卵巢癌的发生、发展及临床预后有关.     

3-甲基腺嘌呤增强口腔鳞癌体外化疗药物敏感性的作用机制

目的：通过在口腔鳞癌Tca83细胞培养过程中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）,观察顺铂（DDP）对口腔鳞癌Tca83细胞的杀伤作用,探讨3-MA增强口腔鳞癌化疗药物敏感性的作用机制。方法： 将对数生长期口腔鳞癌Tca83细胞分为对照组、3-MA处理组、DDP处理组、3-MA+DDP处理组和DDP+3-MA处理组,用MTT法检测细胞生存率,激光共聚焦显微镜检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：Tca83细胞株对顺铂IC₅₀值为5 mg/L;MTT检测,DDP组细胞生存率显著低于对照组和DDP+3-MA组 (P<0.05),高于3-MA+ DDP组 (P<0.05);细胞免疫荧光检测,3-MA组平均荧光强度显著低于其他4组（P<0.05）;流式细胞术检测,DDP组细胞凋亡率显著低于3-MA+DDP组 (P<0.05),高于DDP+3-MA组 (P<0.05)。结论：不同水平的自噬对口腔鳞癌细胞的作用不同,抑制细胞自身基础水平的自噬可增强DDP对Tca83细胞的杀伤作用,提示自噬抑制剂有望成为口腔鳞癌的化疗增敏剂。     

生存素在骨肉瘤的表达及意义

目的　探讨生存素在骨肉瘤中的表达与骨肉瘤的生物学特性的关系。　方法　采用免疫组织化学SP法检测5 2例骨肉瘤、15例骨软骨瘤及15例正常骨质标本的生存素蛋白表达。　结果　生存素蛋白在骨肉瘤中的表达显著高于骨软骨瘤和正常骨质(P <0 .0 5 ) ,在肿瘤的侵袭转移方面差异有显著性(P <0 .0 5 ) ,而在性别、年龄、肿瘤直径、病理类型、病理分级及临床分期等方面差异无显著性(P >0 .0 5 )。　结论　生存素在侵袭转移的骨肉瘤呈高表达,提示其在骨肉瘤的发生和发展中起重要作用。     

凋亡基因bcl-xl在骨肉瘤中的表达

目的探讨肿瘤凋亡基因bcl-xl在骨肉瘤发生中的作用。方法采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(SP法)检测27例传统骨肉瘤和22例良性软骨骨瘤中的bcl-xl的表达,表达程度采用半定量方式判定。结果bcl-xl在骨肉瘤中表达的阳性率为100%,软骨骨瘤中表达的阳性率为4.5%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论骨肉瘤不同分化与阳性半定量间无相关性(P>0.05)。bcl-xl蛋白表达与骨肉瘤的发生有关,但与骨肉瘤的分化程度无关。     

营养剥夺诱导的脂肪细胞自噬及与Beclin1的关系

目的探讨3T3-L1脂肪细胞在营养剥夺状态下自噬的发生及自噬相关基因Beclin1的变化。方法培养3T3-L1脂肪细胞至不同诱导分化时期,对照组不做特别处理,营养剥夺组以Hanks液代替细胞完全培养液3 h,形成营养剥夺状态。采用透射电镜观察自噬体;转染携带微管相关蛋白1轻链3(LC3)的绿色荧光蛋白慢病毒(LC3-GFP-LENTIVIRAL)质粒系统,病毒扩增后感染3T3-L1靶细胞,荧光显微镜下观察LC3-GFP点状聚集;蛋白免疫印迹分析检测自噬抗体LC3以及Beclin1的变化;双荧光素酶报告基因检测Beclin1基因转录区(Promoter)及3′非编码区(3′UTR)的变化。结果营养剥夺组自噬体数量较对照组增多;营养剥夺组较对照组LC3-GFP点状聚集增多;营养剥夺组LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达较对照组升高;与对照组相比,营养剥夺组Beclin1-Promoter及Beclin1-3′UTR相对荧光单位呈倍数增高,差别有统计学意义(P<0.01)。结论营养剥夺可以诱导3T3-L1脂肪细胞发生自噬;营养剥夺诱导的自噬与Beclin1相关,可同时影响Beclin1基因的转录与mRNA稳定性。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

自噬基因Beclin 1在SKOV3细胞中的表达及其调控相关信号传导途径的研究

目的探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达后自噬相关信号调控通路PI3K/PKB途径中ClassⅠPI3K（p110α）、p-PKB和ClassⅢPI3K（hvps34）的表达变化以及对肿瘤细胞的自噬活性的影响.方法将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞;分别用荧光定量RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平检测用流式细胞仪检测Beclin1、p110α、hvps34和p-PKB的表达;在电镜和荧光显微镜下观察自噬现象,用流式细胞仪检肿瘤细胞自噬情况.结果 pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞Beclin1表达在mRNA和蛋白质水平明显高于转染空质粒pcDNA3.1和未转染细胞;PcDNA3.1/Beclin1转染后hvps34表达上调,而p110α、p-PKB的表达下调.PcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在在电镜下可见大量自噬囊泡形成.在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC阳性细胞明显增加.流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%.结论自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可使ClassⅢPI3K（hvps34）表达上调,ClassⅠPI3K（p110α）及其下游的p-PKB表达下调,诱导肿瘤细胞自噬活性增加,抑制SKOV3在体外的增殖.     

FAS在骨肉瘤组织中的表达研究

目的研究脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS）在骨肉瘤组织中的表达情况。方法对20例骨肉瘤患者的石蜡标本进行FAS的免疫组织化学染色分析,并与19例骨软骨瘤组织进行对照。结果FAS在骨肉瘤组织中高表达,阳性表达率100%（20/20）;FAS在骨软骨瘤组织中表达低,阳性率为73.68%（14/19）,两者阳性率的比较有显著性差异（P〈0.05）。结论FAS在骨肉瘤组织中过表达,可作为骨肉瘤治疗新的靶位。     

p15蛋白在骨肉瘤中表达的研究

目的:研究p15蛋白在骨肉瘤中的表达,探讨其表达与骨肉瘤的相关性。方法:采用S-P免疫组化方法,检测22例骨肉瘤中p15的表达;结果:p15蛋白在22例骨肉瘤中表达的阳性率为54.5％,而20例骨软骨瘤中阳性率为15.0％。骨肉瘤p15蛋白表达与骨软骨瘤相比差异具有统计学意义(x2=7.13,P<0.01)。结论:p15蛋白的表达与肿瘤的恶性度相关,与骨肉瘤的发生、发展具有相关性。     

大鼠急性肾损伤后自噬相关蛋白Beclin-1的表达

目的研究自噬相关蛋白Beclin-1在大鼠急性肾损伤伤后肾组织中的表达情况,并探讨其意义。方法选用24只雄性大鼠sD大鼠,体重250±30g,按随机数字表法分为两组,假手术组（Sham组）和缺血-再灌注组（I／R组）;各组于再灌注后12、24、48h3个相应时间点收获肾脏标本。HE染色观察肾脏病理变化,免疫组化法测定自噬相关蛋白Beclin-1的表达情况,透射电镜观察。肾脏组织自噬现象。结果与假手术组比较,大鼠急性肾损伤48h,肾小管细胞Beclin-1蛋白的表达最强（P〈0．05）,再灌注损伤后48h,自噬体数量显著增多,细胞内出现染色质块状边集,核形态不规则的明显凋亡现象。结论大鼠急性肾损伤后自噬相关蛋白Beclin-1的表达上调,说明大鼠肾急性。肾损伤后肾脏组组织自噬活性上调。